论文部分内容阅读
菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)二年生草本植物,其干燥根与叶分别为板蓝根(IsatidisRadix)和大青叶(IsatidisFolium),为我国传统中药。板蓝根和大青叶具有清热解毒,凉血利咽之功效,主治发热咽痛,温毒发斑,痄腮,昏迷,烦渴。菘蓝主要栽培于河北、安徽、甘肃、黑龙江等省,在我国很多地区均有分布。本研究以分布于我国14省39个菘蓝居群为材料,综合运用数量分类学、分子生物学及中药化学的方法,从外部形态、分子水平和次生代谢产物三个层次,分析菘蓝的遗传结构与变异,探讨菘蓝种质资源特性及其与药材品质的关系,为菘蓝资源合理开发及优良种质筛选提供理论依据。具体研究内容及结果如下:(1)对菘蓝不同居群的16个表型性状进行了分析,结果显示:不同菘蓝居群在形态学上存在丰富的变异。主成分分析结果表明叶长、叶宽、叶面积、主根长、主根粗及木质部为导致菘蓝表型差异的主要因素。根据形态特征可将39个菘蓝居群分为4个类群。(2)应用扫描电镜(Scanning electron microscope)对菘蓝不同居群的花粉进行形态观察与比较研究。结果表明:菘蓝花粉为长球形至近超长球形,赤道面观为椭圆形,极面观为三裂圆形,3个萌发沟,沟端接近花粉的两极。表面纹雕为网状纹饰,网眼为五边形或六边形至不规则的多边形,网眼内部与其周缘分别分布不同密度的颗粒物及圆柱状基粒棒。不同居群在花粉大小、形状、网脊宽度、网眼大小及密度等方面存在差异。根据花粉形态特征可将39个菘蓝居群聚类为4个类群。(3)利用ISSR(Inter-simple sequence repeats)分子标记技术分析菘蓝遗传多样性。结果表明:在物种水平上,多态性位点百分率(PPL)高达100.00%,Nei’s多样性指数(He)为0.4371。在居群水平上,PPL变化范围为42.07%～71.03%,平均为59.68%。新疆和田、四川广元青川、河北廊坊文安等居群的He及I值均高于其他居群,具有较丰富的遗传多样性。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.4916,表明居群内具有较高水平的遗传分化,且居群间及居群内的遗传变异相差不大。UPGMA法及PCoA法的分析结果相似,菘蓝不同居群基本按地理远近关系分为5个类群。(4)应用 SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)分子标记对39个菘蓝居群进行遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明:在物种水平上,多态位点百分率(PPL)为98.76%,Nei’s基因多样性指数(He)为0.3687,Shannon信息指数(I)为0.5320;在居群水平上,PPL变化范围为40.88%～70.35%,平均为57.55%,甘肃张掖民乐居群最高,河北定州居群最低。甘肃张掖民乐、四川广元青川、新疆和田等居群的He及I值均高于其他居群,具有较丰富的遗传多样性。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.4687,表明居群内的遗传变异较大,居群间也存在一定的分化;聚类分析显示,当相似系数为0.735时,可将39个菘蓝居群分为4个类群,与ISSR分析结果略有差异,但基本呈现一致性。(5)对不同菘蓝居群核糖体ITS2序列进行比较分析。结果显示:ITS2序列长度为191 bp,G + C含量为56.54%,1个简约信息变异位点,单倍型多样度(Hd)为0.689,核苷酸多态性(Pi)为0.00803,平均核苷酸差异数(K)为1.533,39个菘蓝居群间的遗传分化距离在0～0.0053之间,来自河北定州的居群具有较高水平的遗传分化。以UPGMA法建立分子系统发生树表明菘蓝居群分为2个类群。此外,ITS2能够将菘蓝与其同属植物区别开来,建议ITS2适合作为菘蓝物种鉴定的DNA条形码。(6)对不同菘蓝居群叶绿体trnL-F序列进行测定及比较分析。结果表明:扩增获得的序列长为758 bp～760 bp,G + C含量为35.62%～35.84%,平均含量为35.76%;整个trnL-F区共有3个变异位点,均为单核苷酸变异。单倍型多样度(Hd)为0.778,核苷酸多态性(Pi)为0.06929,平均核苷酸差异数(K)为1.875。39个菘蓝居群之间遗传分化距离为0～0.0013;构建的UPGMA系统发育树显示39个菘蓝居群分为2个类群,与ITS2序列分析结果略有差异,但基本呈现一致性。(7)对不同菘蓝居群叶绿体rbcL序列进行比较分析。结果显示:rbcL序列长553 bp～555 bp,G + C含量为43.16%～43.60%,平均含量为43.28%;rbcL序列共有4个单核苷酸变异位点,遗传分化距离为0～0.0017;UPGMA系统发育树表明39个菘蓝居群分为2个类群,与ITS2、trnL-F序列分析结果略有差异,但基本一致。(8)以表告依春、靛蓝、靛玉红、总生物碱、多糖、总游离氨基酸等主要生物活性成分为评价指标,对不同菘蓝居群及相同居群不同部位(根、叶)进行质量评价研究。结果表明:不同居群菘蓝中活性成分含量存在显著差异,表告依春含量在1.166 mg·g-1～3.912 mg·g-1 之间,靛蓝含量在 2.080 mg·g-1～8.630 mg·g-1 之间,靛玉红含量在0.895 mg·g-1～2.751 mg·g-1之间。同一居群叶中所含的总生物碱含量(1.027%～3.827%)高于根中总生物碱的含量(0.089%～1.255%),而根中多糖(3.784%～7.852%)、总游离氨基酸含量(1.494%～3.546%)均高于叶中多糖(0.097%～2.713%)、总游离氨基酸含量(0.894%～2.251%)的含量。菘蓝表告依春、靛蓝、靛玉红、叶片和根中多糖及总游离氨基酸含量随纬度的上升呈增加趋势。通过聚类分析将39个菘蓝居群分为4个类群,可根据不同的需求进行优良种质选育,为菘蓝药材质量评价及发展道地药材生产提供一定理论依据。(9)运用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定不同菘蓝居群及同一居群不同部位(叶、根)中9种无机元素的含量。结果显示:在大量元素中,K、Ca含量较高,在微量元素中A1含量最高,其次是Fe和Zn。不同菘蓝居群各元素含量差异显著。叶中所有大量元素及Zn、Mn微量元素的含量均明显高于根中的含量,无机元素间存在显著的相关性。主成分分析表明K、P、Mg、Fe、A1和Mn是菘蓝的特征元素,根据无机元素含量可将39个居群聚为4个类群。