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食管癌是一种常见的恶性肿瘤,尽管临床上手术与放化疗等治疗手段在不断改进,但是食管癌预后依然很差,5年生存率不足20%。有研究报道,可溶性血管内皮生长因子受体2(soluble VEGF receptor2缩写为sVEGFR-2或sVR-2),能结合VEGF-C,阻断相应信号传递,抑制淋巴管生成,提示sVR-2可能是一种有效的淋巴管生成抑制因子。迄今为止, sVR-2在肺癌、胃癌、宫颈癌和神经母细胞瘤中的表达情况及其临床意义已见研究报道,而有关sVR-2在食管癌中的表达情况及其临床意义如何尚不清楚。基于此,本文拟研究食管癌组织中sVR-2与VEGF-C的mRNA的表达水平及其临床意义;克隆sVR-2基因的3′端非翻译区(3′UTR);利用报告基因,初步揭示此3′UTR参与sVR-2基因表达调控的可能性,为进一步深入研究sVR-2在食管癌中的功能及其表达调控机制奠定实验基础。 首先,利用qPCR技术,检测了EC109、EC9706和KYSE180等21种食管癌细胞系或永生化食管上皮细胞系中,sVR-2的mRNA的表达情况。结果发现,1)在21种食管癌细胞系或永生化食管上皮细胞系中,sVR-2的mRNA呈现低表达趋势,但存在一定的异质性;2)与293T细胞相比,14种食管鳞癌细胞系中的9种,2种食管腺癌细胞系中的1种,5种食管上皮永生化细胞系的全部,sVR-2的mRNA低表达。 其次,同样利用qPCR技术,检测了90例冻存于-80~-70℃冰箱中的食管鳞癌配对组织标本中,sVR-2和VEGF-C的mRNA的表达情况。结果表明,1)与配对的相对正常食管上皮组织相比,64.4%的食管鳞癌组织,sVR-2的mRNA显著低表达;2)与sVR-2相反,64.4%的食管鳞癌组织,VEGF-C的mRNA显著高表达;3)相关性分析结果提示,食管鳞癌组织sVR-2的表达水平与临床分期负相关,P=0.02;4)为发现VEGF-C的mRNA的表达水平与食管癌临床病理参数相关。 再次,应用3′RACE法,从食管鳞癌细胞TE-1中,成功获得sVR-2基因的3′UTR,长度136bp,并另外带有一小段Poly(A),系由sVR-2基因在13内含子部位选择性剪接所致。同时,将上述克隆的sVR-2基因的3′UTR插入psiCHECK-2,构建荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK-3′UTR,在TE3和KYSE180食管鳞癌细胞中,检测报告基因活性。实验结果表明,与转染空载体相比,转染psiCHECK-3′UTR的TE3和KYSE180细胞,其荧光素酶报告基因的活性显著增高,提示可能是某增强子存在其中。 最后,成功建立了稳定表达svr-2的食管鳞癌细胞系,并应用多种实验手段予以确证。 综上,本文的主要研究结论,1)食管鳞癌组织标本中,sVR-2的mRNA的表达水平降低,与临床分期负相关;2)食管鳞癌组织标本中,VEGF-C的mRNA表达水平升高,但未发现与临床病理参数之间的相关性;3)成功获得一136bp的sVR-2基因的3′UTR,而且可能有某增强子存在其中;4)成功建立了稳定表达svr-2的食管鳞癌细胞系。