论文部分内容阅读
第一部分线粒体生物发生在氟致SD大鼠神经毒性中的作用目的:过量氟暴露所致神经毒性已引起广泛关注,然而其神经毒性作用机制仍不清楚。前期研究结果证明,氟致神经毒性与线粒体功能损害有关,而线粒体生物发生与线粒体功能损害修复有关。本研究旨在探讨线粒体生物发生在氟致SD大鼠神经毒性中的作用,为阐明氟神经毒性机制提供理论基础。方法:购买60只SD(Sprague-Dewley,SD)大鼠(180~220g,雄:雌=1:2),适应性喂养一周后,将大鼠随机分为4组:对照组(水中氟离子浓度<0.5 mg/L)以及10、50、100 mg/L氟化钠(sodium fluoride,NaF)组。染毒2个月后,按照雄雌性别比1:2合笼,并将怀孕雌鼠单笼饲养,怀孕雌鼠孕期间保持饮水氟暴露。子代断乳后也按亲代的剂量继续饮水氟暴露直至2月龄,取其大脑。采用实时荧光定量PCR检测大鼠海马组织中线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)相对含量;Western blot检测大鼠海马组织线粒体生物发生关键调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor,NRF1)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)以及呼吸链复合物亚基CO2和ATP6的蛋白表达水平;免疫组化检测大鼠海马组织中PGC-1α和NRF1的定位表达情况。结果:实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,100 mg/L NaF组大鼠海马组织mtDNA相对含量显著降低(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组相比,100 mg/L NaF组大鼠海马组织PGC-1α、NRF1、TFAM、ATP6和CO2的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);免疫组化结果显示,NaF染毒组大鼠海马组织CA1区神经元内PGC-1α、NRF1阳性细胞数均小于对照组,随着NaF剂量增加,其阳性细胞数逐渐减少。结论:氟暴露可导致子代二月龄大鼠海马组织中mtDNA相对含量减少,且导致线粒体生物发生关键调控因子与线粒体呼吸链复合亚基的蛋白表达水平降低,说明氟暴露所致神经毒性可能与线粒体生物发生障碍有关。第二部分线粒体生物发生在氟致SH-SY5Y细胞毒性损害中的作用目的:探讨线粒体生物发生在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞毒性损害中的作用,为探索氟神经毒性机制提供理论基础。方法:将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞分为对照组和暴露于不同浓度NaF(20、40及60 mg/L NaF)的染毒组,染毒处理24 h后,通过实时荧光定量PCR检测mtDNA相对含量和线粒体生物发生关键调控因子PGC-1α、NRF1和TFAM以及呼吸链复合物亚基CO1、CO2、CO3、ATP6和ATP8的mRNA表达水平;Western blot检测线粒体生物发生关键调控因子PGC-1α、NRF1和TFAM以及呼吸链复合物亚基CO2和ATP6的蛋白表达水平;采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。用TFAM过表达腺病毒转染SH-SY5Y细胞,检测mtDNA相对含量、线粒体生物发生关键调控因子TFAM以及呼吸链复合物亚基CO1、CO2、CO3、ATP6和ATP8mRNA表达水平和蛋白表达水平的变化情况;采用流式细胞术检测线粒体膜电位和线粒体ROS;以CCK-8试剂盒检测细胞存活率。结果:实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,60 mg/L NaF组的mtDNA相对含量显著降低(P<0.05),且线粒体生物发生关键调控因子PGC-1α、NRF1和TFAM与呼吸链复合物亚基CO1、CO2、CO3、ATP6和ATP8的mRNA表达水平也显著降低(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组相比,60 mg/L NaF组的PGC-1α、NRF1、TFAM、CO2和ATP6的蛋白表达水平显著降低(P<0.05);CCK-8结果显示,与对照组相比,40 mg/L和60 mg/L NaF组的细胞存活率显著降低(P<0.05)。经TFAM过表达干预后,与空载体+60 mg/L NaF组相比,TFAM过表达+60 mg/L NaF组的TFAM、CO2和ATP6蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),其TFAM、CO1、CO2、CO3、ATP6和ATP8 mRNA表达水平也均显著升高(P<0.05);流式细胞术检测发现,与空载体+60 mg/L NaF组相比,TFAM过表达+60 mg/L NaF组的线粒体ROS显著降低,而线粒体膜电位显著升高(P<0.05);CCK-8实验结果显示,与空载体+60 mg/L NaF组相比,TFAM过表达+60 mg/L NaF组的细胞存活率显著升高(P<0.05)。结论:一定剂量的NaF可致SH-SY5Y细胞的线粒体生物发生障碍,降低mtDNA相对含量,损伤线粒体功能,使得细胞存活率降低。而TFAM过表达则能够激活SH-SY5Y细胞的线粒体生物发生,恢复线粒体功能,提高细胞存活率。