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目的:通过观察JAK-STAT通路抑制剂AG490对IGF-1调控人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPCs)增殖、矿化能力及矿化相关基因的影响，探讨JAK-STAT通路在IGF-1促牙髓细胞增殖和分化中的作用。 方法:牙髓细胞分离培养及来源鉴定:选取因阻生或者正畸减数拔除的健康恒牙，采用组织块酶消化法分离、提取牙髓细胞并进行原代培养，当细胞增殖并汇合达孔底80％时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代，牙髓细胞传至3～4代时，选用免疫组化法检测波形蛋白和角蛋白表达以鉴定细胞来源。 IGF-1对人牙髓细胞增殖的影响:以3×103个/孔牙髓细胞接种于96孔培养板中，细胞培养24h后，换无血清DMEM饥饿细胞24h，然后分别用含2％血清浓度的5、10、25、50和100ng/ml IGF-1刺激液继续培养，培养1d、3d、5d和7d，每3天换一次液，每孔加20μlMTT溶液，4h后吸净培养液，每孔加150μlDMSO溶液，酶标仪以490nm波长检测各孔吸光度(OD)值。 IGF-1诱导牙髓细胞增殖过程中JAK-STAT通路的作用:以同样实验条件将牙髓细胞接种于96孔板中，分5组:①对照组②空白对照组③100ng/ml IGF-1组④50μmol/L AG490+100ng/ml IGF-1组⑤50μmol/LAG490组，培养1d、3d、5d和7d采用MTT法检测细胞增殖。 碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析IGF-1对人牙髓细胞的矿化作用:以2×105个/孔牙髓细胞接种于6孔板中，待牙髓细胞融合至80％时，换成以下4组矿化诱导液①矿化诱导液(Control/M)②100ng/ml IGF-1的矿化诱导液③100ng/ml IGF-1+50μmol/L AG490的矿化诱导液④50μmol/LAG490的矿化诱导液，分别刺激牙髓细胞7d、14d和21d，在室温下用4％的多聚甲醛固定30min，分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析。茜素红染色后每孔加入1ml10％氯化十六烷基吡啶，测定562nm波长下OD值。 RT-PCR检测成牙/成骨基因mRNA的表达:在上述4组矿化诱导14d的牙髓细胞中加入1mlTRIzol，参考TRIzol说明书提取总RNA。根据M-MLV第一链合成系统操作说明书反转录获得单链cDNA，使用RT-PCR检测ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA表达。 Western blot及免疫荧光法检测JAK-STAT通路JAK2蛋白磷酸化水平:用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液RIPA将上述4组矿化诱导4h后的牙髓细胞裂解，提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳，随后转至PVDF膜，牛奶蛋白封闭后，分别孵育p-JAK2(1∶1000)与GAPDH(1:1000)一抗及抗兔IgG二抗(1∶20000)，最后用双色红外激光扫描仪进行扫膜，Image J软件分析结果。将处于对数生长期的牙髓细胞消化，以104个/ml浓度的细胞悬液接种于六孔板中，培养24h后，更换为上述4组矿化诱导液，继续培养4h，用4％多聚甲醛固定细胞30min，随后用山羊血清封闭30min，再分别孵育兔抗p-JAK2一抗(1∶100)与抗兔IgG二抗(1∶1000)，最后加入DAPI将细胞核蓝染，立刻在免疫荧光显微镜下观察。 用SPSS13.0统计软件，数据结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析及S-N-K法进行统计学分析，P＜0.05为有统计学意义。 结果: 1.在体外成功分离和培养出人牙髓细胞，免疫组化法鉴定细胞证实牙髓细胞为中胚层间充质细胞来源。 2.通过MTT法检测IGF-1不同浓度(5～100ng/ml)对牙髓细胞增殖的影响，结果为牙髓细胞培养至第5d和7d时，25、50、100ng/mlIGF-1组增殖均高于对照组(P＜0.05)，并随浓度升高，细胞增殖越多，100ng/mlIGF-1组细胞增殖显著(P＜0.01)。本实验发现IGF-1+AG490组可以明显抑制牙髓细胞的增殖作用(P＜0.01)。 3.IGF-1组7d、14d及21d形成的矿化结节含量及ALP染色均明显多于Control/M组，而IGF-1+AG490组矿化结节形成量较IGF-1组少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 4.RT-PCR检测4组矿化诱导液培养14d的人牙髓细胞，发现IGF-1组中ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA表达升高，且差异显著(P＜0.05)，IGF-1+AG490组中ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA水平明显低于IGF-1组(P＜0.05)，与茜素红及ALP染色结果一致。 5.矿化诱导液诱导牙髓细胞4h后，通过Western blot及免疫荧光染色检测JAK-STAT通路中JAK2蛋白磷酸化水平，结果显示IGF-1组磷酸化JAK2(p-JAK2)蛋白表达高于对照组，而IGF-1+AG490组明显低于IGF-1组(P＜0.05)。 结论: 1.采用组织块酶消化法，在体外成功培养出大量人牙髓细胞，并经免疫组化鉴定其来源于中胚间充质干细胞，第3～4代牙髓细胞增殖能力强、细胞形态良好，符合后续实验要求。 2.25～100ng/ml IGF-1可以促进牙髓细胞的增殖，具有浓度依赖性，100ng/ml IGF-1是促进牙髓细胞增殖和矿化的最佳浓度。 3.IGF-1作用于牙髓细胞使JAK2蛋白磷酸化水平升高，IGF-1可能通过JAK-STAT信号通路促进牙髓细胞的增殖和分化，同时可以提高成骨分化蛋白ALP、OCN、OPN和成牙本质分化蛋白DSPP基因的mRNA表达。