【摘 要】
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该研究尝试用不同的方法对bldH基因进行克隆.首先试图通过转座子标签技术对bldH基因进行克隆.对携带有转座子Tn4560的温敏型复制性质粒pUC1169进行了一系列的改造,构建得到重
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该研究尝试用不同的方法对bldH基因进行克隆.首先试图通过转座子标签技术对bldH基因进行克隆.对携带有转座子Tn4560的温敏型复制性质粒pUC1169进行了一系列的改造,构建得到重组质粒pHZ2508,作为新转座子的载体.该质粒在M145中具有较高的转座频率,并且可以通过对转移接合子的直接筛选得到转座突变株.由于发现pSPH2可以反式互补bldH突变株WC109,所以没有继续用pHZ2508进行WC109中bldH的克隆.pSPH2的外源片段包含有3个完整的开放读码框(ORF).将覆盖该区域的科斯质粒2SCC13导入WC109,可以部分互补其光秃表型.对转化子进行松弛培养,筛选同质化(homogenolized)后代,即丢失2SCC13载体抗生的Km后代,发现同质化后代产孢表型发生分离,暗示WC109菌株的染色体在该区域发生了突变.为了进一步定位该突变基因,构建了一系列的亚克隆,并将它们导入WC109.观察产孢表型,将具有使WC109部分恢复产孢功能的区域浓缩定位adpA<,sc>基因.通过PCR扩增分别克隆得到WC109和WC181两种bldH突变株的adpA<,sc>基因,并分别进行测序.将adpA<,sc>基因中的TTA密码子定点诱变成为其简并密码子TTG,得到定点诱变基因adpA<,sc><*>分别引入到整合型载体pSET152和低拷贝载体pHJL401上,然后导入bldA突变株J1700中,发现adpA<,sc><*>基因只有至少存在1~10个拷贝时才可以明显地使J1700部分恢复产孢.这暗示bldA调节形态分化的靶基因不只一个.
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