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研究背景与目的在口腔组织工程研究中,人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)作为成体干细胞,都被证实可以促进颌面部硬组织的缺损修复,对于口腔组织再生有较大意义。然而,hDPSCs与hUCMSCs在细胞来源、体外培养难度、增殖能力、多向分化能力等方面各有优劣,在一定程度上限制了他们的研究与应用。因而,探索优化现有干细胞如hDPSCs与hUCMSCs等的生物学特性的方法很有意义。细胞的旁分泌是指细胞分泌的各种调节因子进入到细胞间隙,对邻近的其他细胞的生物学特性起调控作用。大量研究表明,干细胞具备旁分泌功能,其产生的细胞因子、外泌体等物质可以影响到周围包括组织细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等在内的多种细胞,对他们的增殖、粘附、凋亡等诸多行为起着不同的影响效应。近年来更有学者发现,不同种类的干细胞之间同样可以通过旁分泌作用相互影响增殖、分化等能力,如果能对这些改变加以利用,可能会对推进干细胞在组织工程中的研究进程有潜在价值。已有研究证实,hDPSCs和hUCMSCs都具有旁分泌功能,然而二者通过旁分泌对彼此生物学特性的影响尚不清楚。利用Transwell嵌套建立的细胞间接共培养体系是研究旁分泌的有力模型,可以更好模拟体内环境中两种细胞同时相互影响的状态。因此,本实验利用Transwell嵌套,于体外建立hDPSCs与hUCMSCs的间接共培养体系,以初步探究间接共培养环境中hDPSCs与hUCMSCs的旁分泌对彼此增殖及成骨分化能力的影响。本实验旨在为干细胞旁分泌效应的利用提供理论依据,为优化hDPSCs与hUCMSCs在口腔组织工程中的应用提供新的思路。材料与方法1.利用酶消化组织块法分离、培养原代hDPSCs与hUCMSCs;利用流式技术检测干细胞表面标志,利用成骨、成脂诱导检验多向分化潜能;进行hDPSCs与hUCMSCs的传代与冻存、复苏。2.建立hDPSCs-hUCMSCs体外间接共培养体系,并设置上下层含同种细胞的体系作为对照。间接共培养处理3d、5d时,通过EdU标记法及Western Blot分别测定细胞的增殖活力及周期相关蛋白CDK6与CYCLIN A的表达水平。3.设置预先共培养(间接共培养后进行成骨诱导)组与持续共培养(间接共培养的同时进行成骨诱导)组及各自的对照组,通过QRT-RCR和Western Blot技术分别测定成骨相关mRNA(Col I,RUNX2,OCN)的表达水平及成骨相关蛋白(Col I,RUNX2,OPN)的表达水平。4.通过Western Blot检测间接共培养后hDPSCs内Akt/mTOR通路核心元件表达情况。实验结果1.成功分离培养原代hDPSCs与hUCMSCs;hDPSCs与hUCMSCs皆具有间充质干细胞特异表面标记并可以成骨、成脂分化;成功进行hDPSCs与hUCMSCs的传代培养与冻存、复苏。2.同对照组相比,间接共培养3d及5d后的hDPSCs内EdU标记阳性率提高、CDK6和CYCLIN A蛋白表达水平上升,差异有统计学意义;间接共培养3d及5d时的hUCMSCs内EdU标记阳性率、CDK6和CYCLIN A蛋白表达水平与对照组无显著性差异。3.与对照组相比,间接共培养同时进行成骨诱导的hDPSCs内的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表达量及Col I、RUNX2、OPN的蛋白表达量呈不同程度增加,差异有统计学意义;预先共培养后进行成骨诱导的hDPSCs内的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表达量及ColⅠ、RUNX2、OPN的蛋白表达量呈不同程度增加,差异有统计学意义。与对照组相比,间接共培养同时进行成骨诱导及预先共培养后进行成骨诱导的hUCMSCs内上述指标无显著性改变。4.与非共培养组相比,间接共培养后hDPSCs内Akt、mTOR磷酸化程度增强。实验结论与意义在hDPSCs-hUCMSCs体外间接共培养体系中,hUCMSCs的旁分泌作用可促进hDPSCs的增殖及成骨分化,而hDPSCs的旁分泌对hUCMSCs的增殖与成骨分化能力未见明显影响;间接共培养体系中旁分泌影响hDPSCs特性的机制可能与Akt/mTOR信号通路有关。此研究结果表明,间接共培养体系中hUCMSCs的旁分泌对hDPSCs增殖与成骨有正向促进效果,这为优化hDPSCs与hUCMSCs在组织再生研究中的应用提供了新思路。