研究背景龋病是一种最为常见的,严重危害人类口腔健康的口腔感染性疾病之一。变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)是人类龋病的主要致病菌,其致龋毒力因子主要表现在对牙面的黏附和利用碳水化合物产生多糖以及产酸、耐酸。含有GGDEF结构域的蛋白是近年来发现的一种新型蛋白,其主要功能是参与单磷酸鸟苷环二聚体(bis-(3’-5’)-cyclic dimeric guanosinemonophosphate, c-di-GMP)的合成。c-di-GMP发现于上世纪80年代,已被证实是原核细胞信号转导中一类新的第二信使,它的作用涉及生物膜的形成、毒力因子的表达、细胞间的通讯、激发免疫系统的应答等多个方面,是细菌生存和代谢的关键性调节因子之一。本课题前期的研究中已经证实变形链球菌内部存在c-di-GMP信号通路,该通路介导变形链球菌的生物膜形成及在离体牙釉质表面的黏附,但其作用机制仍无法明确解释,故成为近年来该领域研究的热点。1953年DNA双螺旋结构的发现以及1985年Crick遗传信息传递的中心法则提出后,生命科学获得了极大发展,基因芯片技术是全基因组分析的有力技术平台,是一种对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究方法,能够并行分析大量基因,全面了解各个基因的表达变化,从而迅速获得丰富、全面的生物学信息,由此促进了基因组学的发展。表达谱芯片是将成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上,对来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激下的细胞内mRNA总体表达水平进行检测,从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,可进一步研究基因与基因间相互作用的关系,提供细胞的表达调控信息。研究证实外源性c-di-GMP具有降低变形链球菌生物膜的形成,产酸、耐酸、体外黏附等特性。但c-di-GMP对变形链球菌调节的分子机制扔不明确。S.mutans UA159菌株的全基因组测序于2002年完成。S.mutans全基因包括2030936 bp,有1963个开放阅读框(open reading frame, ORF),其中63%的功能已知,21%的ORF与其他菌的定位相似但功能未知,有16%的ORF是S.mutans所特有的。该基因芯片的出现为本课题的作用机制研究提供了基础。本研究拟以基因芯片技术分析探讨c-di-GMP影响变形链球菌生物学特性的分子机制,首先以外源性c-di-GMP干预变形链球菌UA159,提取其总RNA,并以标准菌株的总RNA作为对照,与变形链球菌全基因组芯片杂交,筛选差异基因,对所选差异基因以RT-PCR进行验证,从而明确c-di-GMP在参与变形链球菌活动过程中,涉及到哪些基因,及其功能如何,为c-di-GMP作用机制的深入研究奠定理论基础。实验目的：利用基因芯片研究c-di-GMP对变形链球菌基因表达谱的影响,筛选差异基因。探讨c-di-GMP如何参与影响变形链球菌多种生物学特性,以便为临床提供研究快捷有效的防龋途径和方法奠定理论基础。实验方法1.变形链球菌UA159接种于BHI固体培养基中,37℃厌氧培养(80%N2,10%H2,和10%C02)48h,挑取单个菌落接种于新鲜配制的BHI肉汤中进行单克隆培养,37℃厌氧孵育24h。取适量过夜培养液接种至新鲜配制的BHI肉汤中,实验组加入适量c-di-GMP,终浓度为200μM；对照组加入等量生理盐水,37℃厌氧孵育8h,分别在0min、30min、1h、2h、4h和8h时取适量菌液,适度稀释,接种至BHI平板,进行活菌计数,并绘制生长曲线。2.按照德国Qiagen公司RNA提取试剂盒说明,分别提取试验组和对照组的细菌总RNA。DU530生化分析仪检测总RNA的质量和浓度。3.利用逆转录试剂盒将实验组和对照组总RNA逆转录成cDNA,纯化产物并进行cy3或cy5的标记。纯化标记产物,用DU530生化分析仪检测其质量和浓度,然后与全基因组芯片杂交。采用生物信息学方法分析c-di-GMP处理前后变形链球菌UA159细胞基因表达谱的改变。4.采用实时荧光定量PCR的方法对基因芯片筛选的差异基因进行验证,选择部分表达上调的基因和表达下调的基因。RNA的提取及逆转录与芯片实验方法相同,按照RT-PCR试剂盒(Invitrogen)说明书进行反应体系的构建及温度的设定。结果1.变形链球菌的培养及鉴定变形链球菌在BHI琼脂培养平板上呈灰白、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径在0.5-0.75mm的圆形突起小菌落。光镜下为G+链球菌,呈球形或椭圆形,直径0.6-1.0μm,呈链状排列,长短不一,短链或分散状排列。快速微量生化板检测其可以分解甘露醇、山梨醇、棉子糖,而对七叶苷和精氨酸则无降解能力。2.RNA质量检测两组细菌的总RNA,在Beckman公司的DU530生化分析仪上检测,对照组RNA浓度为223.5μg/ml, OD260/OD280=1.90;处理组RNA浓度为203.4μg/ml, OD260/OD280=1.96。凝胶电泳检测显示23S,16S和5S的三条带,在三条带外无杂带或弥漫性拖尾,23S RNA带的亮度约是16S的两倍,说明提取的总RNA较为完整,无明显降解,且无DNA污染。3.基因芯片杂交结果采用国内外基因芯片实验的常用标准Ratio’=2和Ratio’=0.5作为差异基因的筛选标准,芯片检测发现,c-di-GMP处理前后基因表达谱变化是：9个基因表达上调。分别是：glgA、glgB、msmF、gftA、lacG、lepB、rgpAc、bacC、apt;6个基因表达下调。它们是：Hrc、ProC、HprT、Pdp、Glk、cdsA。所得数据采用在线工具GO(http://www.geneontology.org/)和PANTHER(http://www.pantherdb.org/)进行分析的结果表明,其中glgA、glgB、gftA、lacG、Glk参与了变形链球菌糖代谢的过程,msmF、lepB、Hrc与变形链球菌某些信号转导相关,rgpAc、bacC、cdsA与变形链球菌包内物质合成相关,apt、ProC、HprT、Pdp则参与变形链球菌氨基酸代谢过程。因此,差异基因主要与细胞趋向性和生物膜形成、信号转导、糖代谢等途径相关。4.实时荧光定量PCR验证结果实验中反映出了表达量的上调与下调,与在cDNA微阵列分析中的表达差异大致相同；由此可知,cDNA微阵列分析的数据是可信的。结论1.通过不同时间细菌记数,确定了c-di-GMP对变形链球菌生长率的影响与对照组相比没有明显区别。2.利用cDNA微阵列技术分析了c-di-GMP对变形链球菌作用的基因表达变化,9个基因(glgA、glgB、msmF、gftA、lacG、lepB、rgpA、bacC、apt)表达上调,6个基因(Hrc、ProC、HprT、Pdp、Glk、cdsA)表达下调。这些差异基因主要与变形链球菌能量代谢活动,生物膜的形成,以及在牙齿表面的黏附等生物学特性相关。3.基因glgA、glgB(参与菌体内糖原的合成),其表达上调后将细菌内多余的碳源合成糖原储存起来,导致变形链球菌生存的重要物质所需能量减少,进而导致变形链球菌的致病能力下降。msmf表达的上调可以降低细菌其他方面的能耗,进而间接影响变形链球菌的致龋性。基因cdsa(甘油磷脂的合成)下调表达后,降低了甘油磷脂的合成,从而影响变形链球菌在生物体表面生物膜形成的量,继而使变形链球菌致龋特性降低。基因pdp(氨基酸代谢)下调表达后,降低了胞嘧啶的分解,从而影响胞内物质的转换继而影响变形链球菌的活力