研究背景及目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌）是原发性肝癌中最多见的一种类型,也是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌高复发、高转移的特征,使得肝癌成为全球范围内一个重大的医疗负担,而且也是影响治疗效果的主要瓶颈。在肝癌术后复发中,由于早期复发预后更差,因此探寻肝癌术后早期复发患者体内的关键分子,对于肝癌的靶向治疗及预后判断具有举足轻重的价值。环状RNA在体内基因调控方面发挥着重要的功能,同时在肿瘤诊断、治疗及预后判断中行使着关键的作用。那么环状RNA在肝癌术后早期复发中是否同样有着至关重要的影响是本研究的重点。我们将围绕环状RNA作为分子标志物对肝癌术后早期复发的评估价值进行研究,并探讨其在增殖、迁移、侵袭、周期、凋亡等方面对肝癌的影响,进一步深究可能的潜在机制,这将有助于肝癌术后个体化辅助治疗手段的拟定,并提供新的更有前景的治疗靶点。研究方法:1.肝细胞癌术后早期复发相关环状RNA的筛选及验证通过对肿瘤大小、数目、切缘、分化程度等临床基线资料进行匹配后,从每组患者中选出3例术后病理组织进行高通量测序,检测术后早期复发组患者的肝癌组织、癌旁组织以及早期无复发组患者的肝癌组织中环状RNA的表达情况,通过趋势分析筛选出可能在肝癌术后早期复发中明显异常表达的环状RNA,利用q PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR）技术进一步验证,以期证实测序结果的可靠性。2.circ＿0005218在肝癌中的鉴定及临床意义选择circ＿0005218作为代表性分子进行深入探究。利用PCR、凝胶电泳、Sanger测序、核糖核酸酶R消化、核质分离、RNA原位杂交等实验,对circ＿0005218结构特点、稳定性及亚细胞定位进行了研究。然后,通过q PCR技术检测人肝癌组织及对应的癌旁组织、肝癌细胞系及人正常肝细胞系中circ＿0005218的相对表达量。最后,统计分析circ＿0005218表达水平与患者早期复发、总生存及无瘤生存等预后情况的关系,并分析患者临床病理指标与circ＿0005218表达水平的相关性。3.circ＿0005218对肝癌细胞生物学功能的影响利用慢病毒转染技术在肝癌细胞系中稳定过表达或沉默circ＿0005218,接着通过CCK-8实验、EDU实验、平板克隆形成实验、划痕实验、transwell小室实验、流式细胞技术、裸鼠皮下移植瘤模型等手段检测circ＿0005218表达量的变化对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、周期、凋亡等生物学功能的影响。4.circ＿0005218在肝癌中的机制研究从生物信息学分析出发,利用双荧光素酶实验、RNA pulldown实验筛选和验证circ＿0005218结合的miRNA,接着从细胞层面进行功能验证,最后深入挖掘miRNA下游调控的靶基因。研究结果:1.肝细胞癌术后早期复发相关环状RNA的筛选及验证在测序结果中,根据术后早期复发癌组织、早期复发癌旁组织、早期无复发癌组织三者表达量大小关系及统计学相关性分析,总共得到8组环状RNA集合,其中两组有统计学意义,只有一组更可能有临床意义。这一组包括57个差异表达的环状RNA,展示出在术后早期复发癌组织中表达量最高、早期无复发癌组织中等表达、早期复发癌旁组织中低表达的趋势。从中挑出一些分子进行q PCR检测,验证了测序结果的可靠性。2.circ＿0005218在肝癌中的鉴定及临床意义我们确认了circ＿0005218为环状RNA结构,并且具备环状RNA稳定性好的特点。亚细胞定位证实circ＿0005218主要位于细胞质内。扩大样本量检测发现,circ＿0005218在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达量分别显著高于相应的癌旁组织和正常肝细胞系,且再一次确认了circ＿0005218在术后早期复发组癌组织表达量显著高于早期无复发组癌组织。临床资料分析得出,circ＿0005218高表达组与肿瘤数目、微血管侵犯、早期复发密切相关。ROC曲线发现,circ＿0005218具有肝癌术后早期复发的预测价值。Log-rank检验显示circ＿0005218高表达组和低表达组之间总生存率和无瘤生存率均存在显著差异,说明肝癌患者circ＿0005218的高表达与不良预后相关,可作为评价肝癌预后的新型有效生物标志物。单因素和多因素分析预后风险因素显示,circ＿0005218高表达是肝癌患者术后死亡和复发的独立危险因素。3.circ＿0005218对肝癌细胞生物学功能的影响circ＿0005218过表达后可以显著促进肝癌细胞系在体内和体外的增殖。相反,circ＿0005218沉默后可以显著抑制肝癌细胞系在体内和体外的增殖。通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验,我们发现circ＿0005218过表达和沉默分别显著促进和抑制了肝癌细胞系的迁移、侵袭能力。流式细胞技术结果显示,过表达circ＿0005218使得肝癌细胞S期细胞显著增多,抑制细胞凋亡;沉默circ＿0005218使得肝癌细胞G2/M期细胞显著增多,促进细胞凋亡。4.circ＿0005218在肝癌中的机制研究miR-31-5p是circ＿0005218的作用靶点,circ＿0005218可以通过海绵吸附miR-31-5p从而影响其活性。miR-31-5p能够部分逆转干预circ＿0005218对肝癌细胞生物学行为的影响,而过表达或沉默circ＿0005218可以影响miR-31-5p下游靶标分子CDK1的表达,以上说明circ＿0005218调控肝癌的具体机制是通过抑制miR-31-5p的活性从而上调CDK1的表达,最终影响肝癌的进展。研究结论:（1）circ＿0005218在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达,并且在术后早期复发患者的肝癌组织中显著高于早期无复发患者。（2）circ＿0005218在肝癌患者肿瘤组织中的表达量与肿瘤数目、微血管侵犯、肿瘤术后早期复发显著相关,可用于肝癌术后早期复发的预测以及术后总生存率和无瘤生存率的评估。（3）circ＿0005218与肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等能力呈正相关。（4）circ＿0005218可以竞争性结合miR-31-5p调控下游关键分子CDK1。