随着日益增长的能源需求,许多国家都已开展了各种可再生能源的开发。比较传统的化石燃料,生物燃料更为环保,且可再生,能完全取代传统的燃料。然而生物燃料的生产原料成本过高限制了当前生物燃料的普及。寻求更为廉价的生物燃料的原料是目前生物燃料研究领域的主要方向。微藻为光合自养微生物,比较于其他油料作物,其具有生长速度快,脂质含量高,且无需耕地不与粮食作物争地等诸多优点,是目前最有优势的生物能源原料。进一步提高微藻的生物量和脂质含量,提高其生物能源产量,将使其在生物能源生产中更具优势,这是微藻生物能源领域的努力方向和研究热点。本论文针对生物能源微藻的基因工程进行了基础研究,主要开展了微藻选取、培养优化以及以进一步基因改造为目的的基础研究,包括,脂质代谢途径研究和基因工程改造微藻的后续研究基因筛选。同时在构建载体进行工程微藻改造过程中,针对实验需要,开发了微藻colony PCR技术。(1)高生物量高脂质微藻的筛选从各地水样中筛选的多株微藻中选取了一株新的微藻藻株,经鉴定为Chlorella sorokiniana,命名为CS-01。该藻株生长速度较快,pH适应范围广,7-10之间均能很好地生长,在pH9时生长最佳；最适培养温度为30℃,20℃～35℃均能较好生长。最适氮源为硝酸钠,也能很好的利用尿素作为氮源,不能较好利用硫酸铵作为氮源生长。也能利用多种碳源生长,其中以葡萄糖生长时,生长和脂质含量最佳。鉴于该藻在生物燃料的应用潜力,选为本研究的目的微藻。(2)目的微藻针对生物燃料生产的培养优化与其他限制培养基中的氮源来提高脂质含量的方法不同,经由兼养、异养和足量铁培养,淡水微藻C. sorokiniana CS-01生物产量和脂质含量都有大幅提升,其中,兼养时,细胞量是光合自养的4.2倍,脂质含量从光合自养的22%左右提高到50%。异养时,细胞量是光合自养的9.2倍,脂质含量超过50%。铁培养时,脂质浓度达到最大为36%,是完全不加铁培养(12%)的3倍,最高细胞浓度为无铁培养物的1.7倍。且该藻株也展现了相对其他小球藻更强的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C. vulgaris更强的铁耐受能力。经兼养和异养的小球藻CS-01的脂质主要为中性脂且饱和度高,能够用于生产高质量的生物燃料。且该藻株展现了相对其他小球藻更强的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C. vulgaris更强的铁耐受能力。(3)在脂质高积累和低积累时脂质合成相关基因表达差异分析通过不同培养条件下,基因表达变化与细胞生长和脂质含量对应关系,本研究发现rbcL基因的表达可以用来反映光合作用的速率；兼养条件下,C.sorokiniana CS-01优先进行异养。在完全异养初期,参与光合作用的rbcL基因仍保留少量表达,但进入稳定期表达量则急剧降低。AccD基因的表达水平除在异养时与残余葡萄糖浓度相关外,在其他培养方式下则与脂质含量相关,因此,可作为在非异养条件下评估脂质含量的分子检验手段之一。C. sorokiniana CS-01同质ACCase和异质ACCase保留着不同分工,但同质ACCase对总的脂质积累贡献较少。铁浓度增高能同时提高rbcL,accD和accl基因的表达量,可能是高浓度的铁造成细胞脂质含量提高的原因之一。(4)在脂质高积累和低积累时Genefishing分析Genefishing方法是研究基因组整体表达差异的简单快捷的方法,并能用来快速寻找那些表达量受特定条件影响显著的基因。经由Genefishing分析了不同浓度铁培养时基因的表达图谱,证实了铁能促进许多基因的表达,同时在Genefishing发现的序列中,经由生物信息学方法,发现了两个可能与脂质合成代谢相关的基因,它们也随铁的浓度的增加而表达量提高。(5)目的微藻的转录组测序及其脂质合成代谢途径分析经由改进的cDNA文库制备方法,本研究首次对淡水微藻C. sorokiniana进行了全转录组测序,并进行了序列片段的拼接,对拼接序列进行基因本体分析和进一步的序列功能注释,获得了该藻大量基因的信息,进一步充实了微藻基因库信息。经由转录文库中出现的基因所编码的酶,预测了从CO2到细胞主要中性脂Triacylglycerols (TAG)合成的完整路径,以及脂肪酸的合成、延长、代谢途径。标记了TAG合成途径上的分支点,进而展现碳流向可能具有的分支,为脂质提高的基因工程指明了方向。本研究也识别了大量与生长和死亡相关的基因。在本研究中获得的大量基因和代谢途径信息,为基因层面改造微藻提供了有力的理论支持。(6)脂质高积累和低积累时全转录组表达差异对微藻在不同脂质高积累和低积累时的全转录库进行了测序,比较了不同培养条件下全基因组的表达差异变化。发现了大量随脂质变化基因,且即使在不同个样品这些基因的表达仍展现了与脂质变化完全相同的关联,其中许多基因目前功能尚未确定,但根据其表达变化,很可能与脂质合成相关,这些基因的进一步解析和验证,将有助于深入了解微藻的脂质合成代谢,以及发现更多新的脂质合成相关基因。此外,也发现了一些功能未知,但在多个样品间都具有超高表达量的基因,其表达操作元件能够为构建高表达载体提供参考。(7)微藻colony PCR技术构建工程微藻的转化过程中需要验证大量的微藻转化体,但是获得PCR验证所需DNA模板却非常费时费力。因此,开发微藻的colony-PCR技术,可以不对微藻进行单独培养和DNA提取,能快捷识别转化子,这能大幅提高基因工程改造微藻的效率。本研究比较了5种colony PCR DNA析出液用于微藻colony-PCR的效果。结果显示Chelex-100效果最好,能够完好地扩增细胞核和叶绿体中基因片段。此外,Chelex-100在colony-PCR过程中展现出强的DNA提取能力、高抗干扰性、良好的DNA保存效果和细胞量变化适应性,对后续的PCR反应影响小。该方法具有高通量地识别微藻转化子的核转化和叶绿体转化的能力,用于微藻基因的扩增,不需繁琐的DNA提取过程,能在微藻的基因改造过程作为DNA检验手段得到广泛的应用。