一、研究背景和目的: 登革病毒（Dengue virus，DV）为黄病毒属成员，是引起登革热（Dengue fever，DF）和登革出血热（Dengue haemorrhagic fever，DHF）/登革休克综合征（Dengue shock syndrome，DSS）的病原体，有4种不同的血清型（1-4型），主要传播媒介是埃及伊蚊和白蚊伊蚊。目前登革病毒感染引起的疾病主要流行于亚洲、非洲、美洲和太平洋岛屿的热带和亚热带地区。我国自1978年以来主要在海南、广东、广西、台湾和福建等东南沿海地区发生。世界卫生组织估计全球每年登革热发病人数约5千万到1亿，并导致25至50万登革出血热病例和2．4万人死亡。登革热已成为全球范围内严重的公共卫生问题，建立快速、简便、高效、廉价的登革病毒实验室检测方法是及时开展临床救治和流行病学调查，并最终控制其传播流行的可靠途径。 对登革热典型病例的临床诊断并不难，根据其临床症状及流行情况即可诊断。但对非典型病例或疑似病例必须进一步作实验室诊断才能确诊，早期快速的诊断也可大大减少DF的发病率和病死率，因此准确快速实验室诊断方法的建立对DF和DHF的确诊至关重要。多聚酶链反应（PCR）是检测病原的一种简便、敏感、特异的分子生物学检测方法，但是由于PCR方法高度敏感，如检测样本或试剂受到微量的目的DNA片段污染后很容易产生假阳性结果，影响其检测结果的可靠性。荧光定量PCR检测方法是将PCR与液相探针杂交相结合一种检测方法，与常规PCR方法相比，它具有特异性更强、敏感性更高、检测速度更快，并能有效地解决PCR污染问题的特点。目前国际公认荧光定量PCR方法是最准确、重复性最好的核酸定量检测方法，已开始用于多种病毒、细菌感染标本的检测，本研究将探讨该检测方法应用于登革病毒感染的早期诊断的可行性。 二、研究方法: 1、用C6/36细胞和乳鼠培养登革病毒，并用于病毒的保种。 2、利用生物信息学技术，系统比较登革病毒基因组和各主要功能基因核苷酸序列同源性，确定不同血清型登革病毒基因组特征。 3、荧光定量PCR方法的初步建立：收集DV1～4型标准株（DV1夏威夷株、DV2NGC株、DV3 H87株、DV4 H241株），提取四个血清型登革病毒的RNA，以之为模板，在现有的荧光PCR检测仪上建立荧光定量PCR方法。 4、敏感性初步评价：将新建立的方法与本实验室已建立常规PCR方法进行敏感性实验比较。利用核酸分析仪检测模板核酸的浓度，进行梯度稀释，以不同稀释度的核酸材料为模板，确定可分别检测到的病毒滴度。 5、特异性初步评价：提取其他黄病毒科成员如西尼罗病毒的核酸，以之为模板，采用新建立的方法进行检测，以确定所建立方法的特异性。 6、临床标本的初步检测实验：利用本实验室已收集的登革热病人急性期血清样本，进行临床标本检测的初步研究，确定本方法在临床应用的可行性。 7、调查阳江市2006年登革病毒的流行情况，根据发病者的年龄、职业分布情况、发病时间等分析其流行及发展趋势，寻找预防控制措施。 三、研究结果: 1、通过细胞和动物培养，收获了四种DV标准株的培养物。 2、DV 3端非编码区的一段序列高度保守，所采用针对该区片段的适用于DV1～4型检测用的通用引物和探针具有可靠性。 3、建立DV荧光定量PCR检测方法，以DV1～4型标准株的RNA为模板，不同型别的DV均可见到阳性扩增曲线，表明所采用的引物和探针及反应体系是合适的。 4、灵敏度的检测。以不同稀释度的核酸材料为模板，检测的灵敏度均达105拷贝/ml。 5、对其他黄病毒科成员如西尼罗病毒的核酸，以之为模板，采用新建立的方法进行检测，无阳性扩增。 6、在所取的10份血清样本中，有6例出现阳性扩增曲线，软件自动分析显示，病毒含量在103～107拷贝/ml。 四、结论: 1、本研究所建立的荧光定量PCR方法可用于登革病毒感染急性期患者血清标本快速诊断。实验中所采用的DV通用探针和引物位于DV全基因组中相对保守的3’ NC端，在理论上可用于登革病毒所有4个血清型的基因检测。以登革病毒4个血清型的标准株提取核酸作为模板，可得到阳性结果，证明所设计引物和探针的有效性。 2、两步法进行RT-PCR，整个过程约需3～4h。采用该方法对10份发热1～2d患者血清样本进行检测，有6份呈阳性反应，初步证明本方法在临床上的有效性，表明该方法可能适合于登革热病人早期诊断。在本研究中，将阳性质粒标准品与样本进行同条件的FQ RT-PCR，在建立标准曲线的基础上，通过软件自动分析得出阳性标本中病毒含量在103～107拷贝/ml。 3、阳江地区登革病毒的流行情况与当地气温偏高、环境卫生条件较差、白纹伊蚊孳生有关。另外因为有部分轻型或亚临床型病例未就诊或被误诊、漏诊，从而扩大了登革病毒媒介的带毒率，这可能是造成局部暴发流行和蔓延的重要原因。