由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)引起的水稻纹枯病与稻瘟病、白叶枯病合称为水稻三大病害。水稻自然品种中迄今未发现对该病原菌免疫和高抗的种质,依靠传统育种技术选育抗病品种的难度较大。本实验室前期研究显示,在水稻中分别超表达药用植物天麻中的一种抗真菌蛋白基因2(GAFP2,Gastrodia Antifungal Protein2)和水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因1(OsPGIP1,Polygalacturonases inhibiting protein 1)均可显著增强水稻对纹枯病的抗性。进一步聚合两个基因并优化其表达方式,有望筛选出表达更特异的抗纹枯病新种质。为此,本研究采用水稻绿色组织特异表达启动子PrbcS和PcyFBpase分别驱动OsPGIP1和GAFP2表达,构建双基因植物表达框“PrbcS::OsPGIP1-PcyFBpase::GAFP2”(以下简称双价基因),并采用双T-DNA植物表达载体进行转化以筛选无标记抗纹枯病转基因新种质,主要结果如下:1、在江苏主栽粳稻品种武运粳24号(WYJ24)和武陵粳1号(WLJ1)中累计获得阳性转基因植株131株(To),根据农艺表型及育性表现初步筛选,最终保留114个阳性转基因系(T1),其中WLJ1背景53个,WYJ24背景61个。2、通过Southern Blot对转基因系中的外源基因拷贝数进行分析,发现绝大多数转基因系中携带外源基因数为3拷贝及以上,单、双拷贝转基因系分别仅有15和9个。筛选到靶基因单拷贝的无标记转基因系4个,靶基因单拷贝筛选标记也为单拷贝的转基因系5个。对各转基因系中的靶基因表达水平进行RT-PCR分析,发现大多数转基因系中的靶基因在叶片中的mRNA转录水平明显高于对照品种,且表达水平与拷贝数间没有相关性。基因表达部位分析结果显示,靶基因主要在叶片、幼穗、叶鞘和茎中强表达,而在根与种子中表达较弱或不表达。通过Western Blot,我们发现各单拷贝转基因系中均积累较强的GAFP2蛋白。这些结果表明,双价基因成功整合至水稻基因组中且主要在水稻绿色组织中强表达。3、对21个单拷贝和双拷贝转基因系进行纹枯病菌接种鉴定。田间鉴定结果显示:转基因系的发病情况总体轻于对照,病级差异达到显著水平;相对于对照品种,转基因系的病级平均最少降低了 0.3级,最高降低了 2.8级,平均减轻1.6级。部分转基因系进行了室内离体接种鉴定,结果显示,多数转基因系的病斑长度显著短于对照品种。室内离体鉴定与田间鉴定结果趋势基本一致。这些结果表明,本研究中的双价基因确实可显著增强水稻对纹枯病的抗性。4、初步考察了 21个转基因株系的主要农艺性状和生育期,发现大多数株系与对照相比在一个或多个性状上存在一定的差异,但不同转化子间很少出现一致的性状变异,表明多数转化子后代株系的性状可能是由组培变异引起的,而不是外源基因直接引起的。通过筛选,获得了少数与对照亲本基本接近或综合农艺性状优异的转基因系。5、采用反向PCR策略对13个单拷贝转基因系中的靶基因插入位置进行分析,共获得5个转基因系中靶基因插入点的旁邻序列,分别位于第1、3、5、9和11号染色体上。利用旁邻序列及靶基因序列设计的特异PCR引物,证实转基因系Y1-3和Y10-1中的靶基因分别位于第1、3染色体上的10.62Mb和4.27Mb位置,另外3个转基因系的验证工作还在进行中。转基因系Y1-3为单拷贝无标记系,其田间抗性相比于对照品种减轻病级2级以上,具有重要的育种利用价值,目前已申请了转基因生物安全环境释放试验。