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全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的并发症占急救科病人死亡率的第一位，而关于SIRS的发生机制目前尚未完全清楚，一般认为由严重创伤、休克导致体内促炎因子增多，白细胞致敏继而活化，以单核／巨噬细胞 （Mon／Mφ）为主的效应细胞反应性过高，通过分泌IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子及释放各种 酶、氧自由基等引起超常的炎症反应，因而可导致组织损伤；革兰氏阴性细菌内毒素（endotoxin，或脂多糖LPS）在SIRS发生中起着重要作用。但LPS不仅可刺激上述炎症介质的产生增加，也可以诱导机体和巨噬细胞产生LPS耐受，表现为TNF-α等前炎因子分泌下降，细胞对刺激的反应性降低，一般认为耐受是机体主动的保护性机制，但可使机体防御功能下降，不利于清除病原微生物。那么SIRS发生时Mφ究竟是致敏还是耐受呢？文献有截然不同的报道，且都报告与病情严重程度相关。 值得注意的是，白细胞致敏和耐受的体外研究虽然很多，但每个实验室往往只偏重于其中一个现象，总的结果较混乱；而我们在查阅、比较文献时发现诱导白细胞致敏和耐受的条件很相似，这就使我们产生了一个想法：即致炎因子在相同刺激条件下可能同时在同一细胞诱导致敏和耐受反应（我们简称为高、低反应并存假说）。曾有文献报道LPS在诱导TNF-α分泌减少的同时，IL－1的分泌增加，但作者采用了多克隆的腹腔Mφ为研究对象，无法排除高、低反应分别由不同Mφ亚群执行的可能性。因此我们用基本可反应单细胞水平的三种Mφ细胞株，在检测多项效应指标的基础上建立了LPS在单一细胞可同时诱导致敏性高反应和耐受性低反应的细胞模型，即：Mφ细胞株RAW264．7以不同浓度LPS预处理1～24h后，洗去LPS，再分别用LPS、MDP、酵母多糖、PAF、fMLP及PMA攻击，测上清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）磷脂酶 A2（PLA2）、超氧阴离子（Op）、IL-1和IL-6的产生。结果：与未预处理组比较，LPS预处理明显抑制了LPS攻击后TNF－α、IL－6和NO的产生，但IL-1的产生却是增加的；O和巩AZ的产生和活性也增强；us预处理后用其它刺激因子攻击，各种效应分子的高低变化也不尽相同。综合分析了LPS诱导耐受和致敏的不同特点（尤其在LPS预处理时间上，诱导耐受可长至2天，诱导致敏可短到小于lh），选定 LPS 10ng／ml作用 18h为最佳条件，此时耐受和致敏效应不仅同时存在，且高低对比明显。在另两株 M4细胞株 J774Al和 P388D也获得相似结果，唯程度有所差别。结论：LPS可同时在单克隆的M4细胞株诱导耐受和致敏两种不同反应；判断耐受或致敏应依据刺激因子和效应指标来决定，不能笼统认为M4细胞处于耐受或致敏状态。 在建立了LPS同时诱导M4耐受和致敏并存的细胞模型后，我们从胞内信号转导分子变化的角度对其机制进行了探讨，在文献提示的基础上，我们提出LPS预处理后细胞内静态钙离子浓度的升高和PKC的活性下降可能与LPS诱导致敏和耐受有关我们简称为 PKC和［Ca”h的分离假说。为证实这一假说，我们首先以不同浓度LPS作用不同时间后，检测用PMA攻击后OI的产生（NBT还原法），并检测了LPS在相同条件处理后细胞内静态钙离子浓度（荧光显微成像系统，Fura－2／AM负载），发现LPS＊ 处理后的静态钙离子浓度叮C子勺川逐渐升高，在7h达最高水平，旧h时仍维持在高水平（！53．24土79．＊vs对照组95．7抖3．26，p＜0＊5）；且在一定范围内，随 LPS浓度增加门～1000nyml)，静态【CaZ勺i也升高；相应地，LPS预处理后对 Oi的致敏程度与静态＊a21i的变化趋势一致。进一步，单纯用A231 87升高细胞内钙离子浓度后也可使叼的产生增加，且为剂量依赖性；用钙螫合剂BAPTA和EGTA处理使细胞内与外无游离钙情况下，LPS预处理不再能使贿产生。以上结果表明 LPS对 OI的致敏作用依赖于细胞内静态厂ahh的升高。 我们用PMA为工具药人为活化或下调PKC，发现TNF－a耐受与PKC活性下降有关，即用 PMA…g／ml作用旧（可使多数 PKC同型表达缺失）可模拟 LPS预处理对再次 LPS攻击后出现的 TNFa分泌减少，而在 LPS预处理后用 PMAlpg／ml作用 lh（可活化 PKC）则可部分反转 TNFa的耐受；在此基础上检测了 LPS长期处理（旧卜）后二种 M4细胞内 7种同型 PKC的表达（western blot，抗 PKC同型a，pl，pZ，5／川二抗体），发现 PKC－a表达均明显降低，此时再用 LPS攻击 PKC活性（westernbfot，抗磷酸 ＿＿＿＿。＿．。～－－－－－－－＊＊＊＿＿＿＿＿ 第二军医大学博士研究生论文 第耳页化P＊C即有活性P＊C的抗体）也明显降低，说明LPs诱导的耐受确与P＊C－rt的表达减少和活性降低有关。另外，利用PKC缺陷型P388DI细胞与RAW264．7和J774A．I比较发现：在P388DI，无论是LPS一次刺激还是LPS预处理后再行LPS攻击处理组，主要与 PKC有关的指标 TNF－a和NO的产生明