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伪狂犬病(Pseudorabies,PR),即奥耶兹氏病(Aujeszky’s disease),是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物患病的传染病。猪是PRV主要的天然宿主,感染PRV会导致严重的神经紊乱、呼吸系统疾病和母猪的繁殖障碍,以及新生仔猪的高死亡率。目前对于猪伪狂犬病的防制主要依靠Bartha-K61疫苗,使该病得到有效控制。自2011年以来,中国许多规模化猪场接种Bartha-K61疫苗的猪群出现新一轮的PR疫情,表明Bartha-K61疫苗不能对当前的PRV感染提供完全保护,且新一轮的PR对我国养猪业的危害巨大,因此一种可针对当前PRV流行变异株的有效疫苗急待开发。本试验成功建立了检测PRV野毒株的荧光定量PCR检测方法,特异性结果显示,该方法只能够特异性检测PRV,对其它病原体无反应,表明该方法具有良好的特异性;灵敏度结果显示,PRV的最小检测下线为37.0 copies/μL,表明该方法具有良好的灵敏性;重复性结果显示,不同浓度标准品模板的批内变异系数为0.214～0.873%,批间的变异系数为0.964～1.233%,且批内和批间的变异系数均小于2%,表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有重复性高、稳定性良好的优点。对201 8年6月至2020年1月的56份河南省的临床样品进行检测,结果显示,PRV的阳性率为17.86%(10/56),表明河南省猪场依旧存在PRV野毒感染。本试验为PRV的早期诊断及其流行病学调查提供了技术保障。将鉴定为PRV阳性的病料接种于ST细胞,成功分离出2株PRV毒株。血清中和试验和靶向PRV gE基因的荧光定量PCR结果显示,本试验分离出的2株PRV毒株为野毒株。对本研究分离的2株PRV野毒株和1份PRV阳性病料进行gE全基因扩增、gE基因序列同源性分析以及遗传进化分析,结果显示,3株PRV野毒株均与国内流行株亲缘关系最近,同属一个分支,说明3株PRV野毒株均为PRV流行株。对PRV流行株在ST细胞上的增殖规律以及致病性进行探究,结果显示,分离株JZ-1-2019在接种ST细胞上第4-24h毒力逐渐上升,第36h达到最高,随后毒力开始降低;动物试验结果显示,分离株JZ-I-2019对小鼠具有致死性,说明流行株ZJ-1-2019为PRV强毒株。本次试验为PRV的检测方法提供技术支持,也为PRV遗传变异情况提供参考依据。本实验室利用同源重组的方法成功构建了 rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株,但传统的同源重组方法效率较低,因此,本试验在rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株的基础上,利用CRISPR/Cas9对外源基因EGFP进行大片段的敲除,获得不带有外源基因EGFP的rPRV NY-gE-/gI-/TK-变异株,随后,我们对该毒株的TCID50、一步生长曲线、理化特性以及稳定性进行探究。结果显示,敲除EGFP后并没有显著影响该毒株的病毒感染力,且该毒株的增长速度略低于亲本毒株;理化特性和遗传稳定性结果显示,该毒株与PRV野毒株的理化特性类似且该毒株具有良好的遗传稳定稳定性;将本实验室保存的rPRVNY-gE-/gI-,rPRV NY-gE-/gl-/TK-病毒液经甲醛灭活后,分别与MONTANIDETM SIA201 VG佐剂和MONTANIDETM GEL PR佐剂混合,制成4种灭活制剂,将4种灭活制剂及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,通过ELISA试验、中和试验及攻毒保护试验,来鉴定4种灭活制剂的免疫原性。结果显示,4种灭活制剂均可以有效刺激小鼠产生特异性抗体,且对PRV野毒的攻击均具有一定的抵抗力,其中,rPRV NY-gE-/gl-/TK--GEL灭活苗的免疫效果较差,其余3组无明显差异,但rPRV NY-gE-/gI-/TK--201灭活苗由于缺少TK基因,因此更加安全。本研究将为猪伪狂犬病毒变异株的防控及净化提供理论基础和科学依据。