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研究背景与目的：多药耐药(multidrug resistance, MDR)是目前白血病治疗中的一大难题,近年来认为信号传导通路异常激活、凋亡相关基因表达异常、细胞信号调控网络失衡、药物膜转运蛋白如P-glycoprotein (P-gp)和multidrug resistance related protein (MRP)表达上调等,是白血病细胞耐药的重要机制。多种实体瘤如胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌的发生都与Hedgehog (Hh)通路失调控相关。在白血病的多药耐药方面,最近研究表明髓系白血病细胞的耐药性和Hedgehog通路的活化有关。Hedgehog蛋白质家族在哺乳动物中包含三个成员,分别是Shh (Sonic hedgehog)、Ihh (Indian hedgehog)和 Dhh (Desert hedgehog),其中Shh表达最为普遍。Sonic hedgehog通路主要由信号分子Shh,12次跨膜蛋白patched (Ptch),7次跨膜蛋白smoothened (Smo)、一些中间传递分子以及核转录因子Gli-1、Gli-2和Gli-3构成。当Hh通路被抑制时,Smo的活性也被Ptch所抑制,其下游的转录因子Gli在蛋白酶体(lysosomal)内被裁断,其以羧基端被裁断的形式进入细胞核内,下游相关靶基因的转录同时被抑制。而当该通路激活后,通过Ptch和Hh的结合从而解除对Smo的抑制作用,促使转录因子Gli与蛋白激酶A (PKA)形成大分子复合物,从而完整的Gli蛋白便进入细胞核内激活下游一系列靶基因的转录,从而造成化疗耐药。LDE225是一个新的选择性作用于Smo的Hh通路抑制剂,近年来已用于多种实体瘤的耐药研究,但其在白血病的体内研究中仍处于初步阶段。迄今为止仅有一位日本学者通过建立BCR-ABL1(+)全身白血病小鼠骨髓模型,证实Smo抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合使用可清除T315I突变的B CR-ABL1 (+)白血病细胞,显著延长慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)和ph+的急性淋巴细胞白血病(Ph+Acute lymphocytic leukemia, Ph+ALL)小鼠的生存时间和抑制肿瘤细胞生长,且明显优于单药治疗。然而在体内应用Hh信号通路抑制剂与化疗药物联合逆转白血病耐药尚乏研究报道。HL60/ADM细胞是学者们普遍认为的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)多药耐药细胞株,我们的前期结果发现,与非耐药细胞株HL60及非难治性AML原代细胞相比,耐药株HL60/ADM及难治性AML原代细胞中存在shh通路的高表达。LDE225单药处理HL-60/ADM细胞能够提高细胞阿霉素摄取率,逆转耐药,其机制可能是通过下调细胞内Gli-1、IRS-1、p-Akt、 MRP1蛋白的表达而起到逆转耐药的作用。为了进一步验证它们在体内的抗瘤作用及其耐受性,我们建立了HL-60/ADM白血病细胞移植瘤裸鼠模型,研究LDE225单药或联合阿霉素(Adriamycin, ADM)的体内抗瘤活性、毒性作用及其作用机制,试图为临床治疗提供依据。研究方法：1、以200u1 PBS重悬,每只裸鼠皮下注射1×107个HL60/ADM细胞,建立HL60/ADM白血病细胞移植瘤裸鼠模型,观察移植瘤体积达2mm×2 mm大小时,开始进行不同治疗组实验。2、分组治疗方案：根据移植瘤体积大小,将荷瘤裸鼠随机分为6组：A组(对照组：0.5%甲基纤维素和0.5%吐温的PBS, d1～10)、B组(ADM单药组：3mg/kg/d, d1、4、7)、C组(LDE225单药组：80mg/kg/d,d1-10) .D组(LDE225同时联合ADM组：LDE225 80mg/kg/d, d1～10+ADM 3mg/kg/d, d1、4、7)E组(LDE225提前应用2天后联合ADM组：LDE225 80mg/kg/d, d-2～10+ADM 3mg/kg/d, d1、4、7)、F组(LDE225提前应用5天后联合ADM组：LDE22580mg/kg/d,d-5-10+ADM 3mg/kg/d, d1、4、7),每组有7只裸鼠。3、游标卡尺逐日测量移植瘤体积,公式如下：移植瘤体积(mm3)=1/2×长径×短径×短径。按照移植瘤体积计算各治疗组荷瘤裸鼠的抑瘤率,即：(1-治疗组平均体积/对照组平均体积)×100%。同时观测不同治疗组移植瘤裸鼠的生存时间。4、观测移植瘤裸鼠的一般状态,主要为精神、活动、进食进水量、大小便和体重等。用药前及用药后每隔3日监测不同用药组移植瘤裸鼠外周血白细胞(White blood cell,WBC)、红细胞(Red blood cell,RBC)和血小板(Platelet,PLT)的变化,以此来评估骨髓抑制的程度。5、病理学及细胞形态学检测：取全部用药结束当天和临终前移植瘤裸鼠的瘤组织做病理学检测,评估移植瘤组织的病理学改变。对用药结束当天移植瘤裸鼠骨髓进行涂片,瑞士染色油镜下检查有无白血病细胞浸润。取用药结束当天和临终前移植瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾脏器,评估有无病理学异常及瘤转移。6、应用免疫组织化学方法,对6组HL60/ADM白血病移植瘤组织标本,经过抗原修复等,分别进行Gli-1、IRS-1、p-Akt和MRP1蛋白水平的检测。7、以SPSS 13.0软件进行数据分析,给药前后不同时间对实验裸鼠移植瘤体积及体重的影响采用重复测量方差分析,各治疗组的瘤体大小、裸鼠生存期及外周血WBC、PLT和RBC的变化比较用单向方差分析,Levene检验方差齐性,若方差齐使用Bonferro ni方法进行多重比较,若方差不齐则使用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett’s T3方法进行多重比较。当P<0.05时视为差异有显著性。研究结果：1、用体外培养的HL60/ADM细胞株皮下接种,有33.3%的裸鼠成瘤；以HL60/ADM皮下移植瘤原代细胞接种,成瘤率为81.8%。移植瘤仅在注射部位的皮下局限性生长,所有实验小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器和骨髓中均无瘤转移。细胞形态学检测可看到移植瘤涂片中多数细胞为髓系的原始细胞,核仁明显,少数为分化的早幼粒细胞。2、移植瘤体积在给药前后不同时间之间有显著性差异(F=659.38,P<0.001),6个不同治疗组之间也存在显著差异(F=69.09,P<0.001),以LDE225-5d+ADM组、LDE225-2d+ADM组和LDE225+ADM联合组移植瘤体积增长最慢,其次为ADM或LDE225单药组,最后是对照组。LDE225-5d+ADM组、]DE225-2d+ADM组和ADM+LDE225联合组移植瘤体积分别从给药第7、8、8天时开始与对照组间出现显著差异,而ADM和LDE225单药组与对照组间均无统计学差异,观察至用药第15天上述差异越来越明显。各治疗组的抑瘤率分别是：ADM单药组17.1%, LDE225单药组10.6%,ADM+LDE225联合组69.0%,LDE225-2d+ADM组73.7%, LDE225-5d+ADM组76.7%。3、实验各组荷瘤裸鼠生存时间存在显著差异(F=16.97,P<0.001),其中LDE225-5d+ADM组、LDE225-2d+ADM组和ADM+LDE225联合组荷瘤裸鼠存活时间分别为36.67±0.577天、35.33±±1.528天和35.00±2.000天,显著长于对照组(P值分别为0.006、0.003和0.000)、LDE225单药组(P值分别为0.02、0.011和0.001)和ADM单药组(P值分别为0.011、0.006和0.001),而ADM单药(30.67±0.577天)、LDE225单药(31.00±1.00天)与对照组(30.33±0.577天)间无显著性差异。4、整个用药过程中,LDE225单药组移植瘤裸鼠的精神状况、活动、饮食等一般情况与对照组间无显著差异,该组裸鼠体重随用药时间的延长逐渐增加,在用药前后各时间点间有统计学差异(F=60.316,P<0.001)。而ADM单药组裸鼠体重于用药第5天后与对照组相比显著减轻,用药第11天恢复至与对照组无统计学差别。而LDE225+ADM联合组、LDE225-2d+ADM组和LDE225-5d+ADM组与对照组相比,用药第3天之后体重减轻,但均于用药第13天之后逐渐恢复至与对照组间无统计学差异。5、监测各组血常规结果发现,ADM单药组、LDE225+ADM联合组、LDE225-2d+ADM组和LDE225-5d+ADM组WBC和PLT均于用药第10天降至最低点,各组WBC(×109/1)最低值分别为2.58±0.30、1.28±0.63、1.88±0.75和2.03±0.10,PLT(×109/1)最低值分别为449.25±77.45、243.25±89.14、335.50±115.14和218.75±65.78,15天左右恢复至初始水平,上述各组RBC无明显下降。LDE225单药组WBC、PLT和RBC均无明显下降。6、用药结束时,各组移植瘤组织病理学检测可见：对照组瘤细胞分布密集,胞体较大,异型性明显,核浆比例增高,胞浆嗜碱性；ADM单药和LDE225单药组瘤细胞分布密度较对照组有所下降,凋亡小体散在分布；不同方案联合治疗组瘤细胞密度较单药组进一步下降,可见凋亡细胞和凋亡小体呈小片状分布。移植瘤裸鼠终末期瘤组织中均为大片状坏死,可见散在分布的凋亡细胞和凋亡小体。7、各实验组移植瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织病理学检查均无明显异常。骨髓中均可见有核细胞增生活跃,粒红比例正常,环形粒细胞多见,未见到HL60/ADM样白血病细胞浸润。5个治疗组与对照组相比,均无明显的骨髓抑制情况。8、用药结束时,各组移植瘤组织免疫组化检查可见：检测不同用药组移植瘤组织Gli-1、IRS-1、p-AKT和MRP1蛋白表达情况,发现ADM单药组与对照组上述各蛋白表达强阳性(+++),而LDE225单药组、ADM+LDE225联合组、LDE225-2d+ADM联合组和LDE225-5d+ADM联合组Gli-1蛋白表达阴性(-)IRS-1、p-AKT和MRP1蛋白表达阳性(+),说明LDE225作用后移植瘤组织上述各蛋白表达明显降低。结论：1、LDE225联合ADM能显著增强其对HL60/ADM白血病细胞移植瘤裸鼠的抗瘤作用。2、LDE225具有逆转耐药作用,其机制可能是通过下调Gli-1/p-Akt/MRP1表达水平达到的。3、LDE225单独或联合ADM作用后,移植瘤裸鼠骨髓抑制及毒副作用可耐受。