木质纤维素是地球上储量最大的可再生的生物质资源。在其降解过程中,至少需要三种纤维素酶的协同作用,即内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BGase)。食木性白蚁是纤维素消化率最高的昆虫,亦被称为自然纤维素的主要降解者和分泌产生纤维素酶的最大群体。白蚁纤维素酶主要包括外源性纤维素酶和内源性纤维素酶,其自身由唾液腺组织和中肠细胞分泌产生EGase和BGase,属于内源性纤维素酶。为完成纤维素类食物的消化与吸收,白蚁需要外源性纤维素酶的协助：低等白蚁由后肠共生微生物提供,而高等白蚁后肠缺乏原生动物,主要通过取食其巢体上的共生真菌来获取。本文在前人对黑翅土白蚁体内纤维素酶活性及编码基因异源表达研究的基础上,进一步克隆编码成熟纤维素酶基因,切除信号肽,利用常用的酵母表达系统,实现蛋白酶的分泌型表达,并对其酶学性质做了初步探究,为今后进一步优化毕赤酵母表达纤维素酶的发酵条件,及更好地服务工业化应用生产单糖或生物乙醇奠定了基础。1编码成熟纤维素酶基因的克隆通过提取黑翅土白蚁工蚁唾液腺的总RNA,经反转录和克隆得到黑翅土白蚁体内编码编码内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)和β-葡萄糖苷酶(BGase)的成熟肽和完整蛋白的cDNA序列：OfEG和OfBG,即已去除基因前端的信号肽序列,为进一步的胞外表达做准备。2纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达通过PCR将目的基因的两端都加上SacⅡ和Xbal酶切位点,插入到常用的分泌型毕赤酵母表达载体pPICZaA中,分别构建重组质粒pPICZaA-OfEG和pPICZaA-OfBG。通过电转化法,将重组质粒线性化后导入宿主菌株毕赤酵母KM71中表达。挑取高拷贝的重组子克隆进行诱导表达,结果显示SDS-PAGE蛋白条带虽不清晰,但利用带His标签单克隆抗体进行Western blot分析得到位于45.0和66.2 kDa之前的两条带,证明两种目的蛋白的胞外表达得以成功实现。经过发酵培养条件的进一步优化,明确了适用于表达工作的最佳甲醇诱导浓度1.5%和最佳初始pH6.0。此外,还初步探究了两种重组纤维素酶的部分酶学性质。研究结果表明：重组EG的最适反应pH为5.5,最佳反应温度为45℃,重组BG的最适反应pH为6.0,最佳反应温度为50℃；不同金属离子对两种重组纤维素酶的酶活影响不同,表现为：正二价金属离子Mn2+、Zn2+、Cr2+对重组EGase和重组BGase的酶活都具有促进作用,其中Mn2+相对活力均超过150%；而Cu2+对两者都表现出明显的抑制作用；正一价金属离子K+、Na+对两种酶的活力没有明显影响；将两种重组纤维素酶按不同配比混合进行协同作用试验,结果表明混合酶的酶活均高于单个重组酶的酶活,表现出明显的正协同作用。且当配比为1：1时,正协同作用效果最佳,滤纸酶活达0.448U,比相同条件下测得的重组EGase和重组BGase的PFA分别约高出75.00%、113.3%。本研究从黑翅土白蚁中获取了编码成熟的内切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶两种纤维素酶的基因OfEG和OfBG,并构建了重组表达质粒pPICZaA-OfEG和pPICZaA-OfBG,在毕赤酵母KM71中实现了分泌表达。同时还对表达产物进行了部分酶学性质的研究,一方面丰富了白蚁内源性纤维素酶的异源表达和酶促反应最佳条件的探究,另一方面也为今后深入开展纤维素酶异源表达及功能研究提供了借鉴,并为其商业化生产应用提供了支持。