【摘 要】
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目的:探究鞣花酸（EA）对血管内皮氧化损伤的保护作用及机制和其对糖尿病所致动脉粥样硬化大鼠肠道微生物的影响。为鞣花酸发挥血管内皮保护作用提供理论依据。方法:（1）基于高通量测序探究鞣花酸对HUVEC的保护作用高通量测序法探究鞣花酸对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）基因表达的影响,筛选抗氧化相关基因并进行验证。通过实时荧光定量PCR探究鞣花酸不同浓度、不同干预时间对抗氧化基因mRNA表达量的影响,据此
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目的:探究鞣花酸（EA）对血管内皮氧化损伤的保护作用及机制和其对糖尿病所致动脉粥样硬化大鼠肠道微生物的影响。为鞣花酸发挥血管内皮保护作用提供理论依据。方法:（1）基于高通量测序探究鞣花酸对HUVEC的保护作用高通量测序法探究鞣花酸对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）基因表达的影响,筛选抗氧化相关基因并进行验证。通过实时荧光定量PCR探究鞣花酸不同浓度、不同干预时间对抗氧化基因mRNA表达量的影响,据此确定最佳作用浓度与时间。通过免疫印迹法（Western Blot）研究鞣花酸对HUVEC中抗氧化蛋白表达水平的影响。（2）鞣花酸对HUVEC氧化损伤模型的治疗作用构建两种氧化应激模型:（①高糖诱导氧化应激模型;②H2O2诱导的氧化应激模型,MTT法检测细胞增殖）。两种模型中,均将细胞分为五组（①正常组;②模型组;③EA低剂量组;④EA中剂量组;⑤EA高剂量组）,测定EA对细胞模型存活率的影响。测定各组细胞上清液NO和LDH的释放量及细胞内MDA和GSH-px的含量。选取EA治疗效果较好的模型,通过实时荧光定量PCR及Western Blot测定各组抗氧化基因NQO1、HO-1和SOD2的mRNA以及蛋白表达水平量。（3）鞣花酸对糖尿病所致动脉粥样硬化大鼠肠道微生物的影响利用高脂高糖饲料和链脲佐菌素（STZ）建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型。以100mg·kg-1·day-1EA连续灌胃四周,处死大鼠,收集大肠内容物测定肠道微生物。收集胸主动脉进行组织形态学分析。结果:（1）鞣花酸可以诱导HUVEC中抗氧化基因的表达高通量测序结果显示,HUVEC经EA处理后,198个基因上调,280个基因下调。心血管疾病KEGG通路富集筛选得到上调的抗氧化基因如下:NQO1、HO-1和SOD2。实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示EA可诱导HUVEC细胞中NQO1、HO-1 和 SOD2 的表达。（2）鞣花酸可发挥对HUVEC氧化损伤模型的治疗作用成功构建了两种HUVEC氧化损伤模型:①高糖模型:55 mM D-glu孵育细胞24 h;②H2O2模型:400 μM H2O2孵育细胞4h。MTT结果表明,EA可提高两种模型细胞的存活率。氧化与抗氧化指标表明,EA可以提高两种模型细胞的抗氧化能力。具体表现为:EA可以降低模型组细胞中MDA的含量及LDH的活性。EA可以促进模型组细胞NO的释放、增加模型组GSH-px的活性。实时荧光定量PCR及免疫印迹结果表明鞣花酸可以增加模型组中NQO1、HO-1和SOD2的mRNA及蛋白表达量。（3）鞣花酸可调节糖尿病所致动脉粥样硬化大鼠的肠道菌群H＆E染色结果显示EA可减轻模型组大鼠主动脉内膜动脉粥样硬化。肠道微生物测序结果表明,EA可以增加模型组大鼠肠道菌群多样性。门水平上,EA可以增加模型大鼠肠道内厚壁菌门（Firmicutes）的丰度,减少拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度。属水平上,EA可增加模型组大鼠肠道内有益菌属:乳酸杆菌属（Lactobacillu s）,瘤胃球菌属（Ruminococcus）、支原体菌属（Allobaculum）和毛螺菌属（Lach nospira）的丰度;降低有害菌属:Turicibacter、梭菌属（Clostridium）和密螺旋体属（Treponema）的丰度。结论:鞣花酸可以通过增加血管内皮细胞中抗氧化基因NQO1、HO-1和SOD2的表达量和增强细胞抗氧化能力来保护血管内皮免受氧化损伤。此外,鞣花酸可增加糖尿病所致动脉粥样硬化大鼠肠道内有益菌群的丰度,减少有害菌群丰度;发挥对病理大鼠的肠道菌群的调节作用。研究结果为鞣花酸保护血管氧化损伤的机制提供了新的理论依据。
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