由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的乙型肝炎(简称“乙肝”)是严重危害人类健康的重大疾病。全球约有三亿五千万乙肝患者及无症状携带者,其中近一半在中国。大部分新生儿以及约5%左右的成年人感染HBV后不能及时清除病毒而发展为慢性肝炎。HBV慢性持续性感染与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。目前研究认为免疫系统介导的宿主与病毒的相互作用决定着HBV感染后病毒的清除和肝炎病变的进程。IFN-α(Interferon-α)能够诱导多种抗病毒蛋白表达,并且能够激活先天和适应性免疫应答从而发挥强大的抗病毒效应,是目前临床上治疗慢性乙肝(CHB)感染的一线药物,并取得相对较好的治疗效果。宿主体内外周血干扰素-α主要由外周血中的浆样树突状细胞(pDCs)产生,因此,pDCs及其分泌的干扰素在宿主抗病毒过程中扮演重要角色。有大量研究表明慢性乙肝患者外周血中pDCs数量下降且功能受损,且CHB患者经拉米夫定抗病毒治疗,病毒载量降到检测水平以下时,pDCs的数量出现回复性升高,提示HBV可能影响了pDCs的数量和功能,并推测这可能是HBV导致慢性持续性感染的原因之一。目前pDCs受HBV影响的具体机制还不清楚,本课题拟对此作进一步探索。首先证实慢性乙肝患者PBMCs用Toll样受体9(TLR9)的配体CpG A刺激后,其产生IFN-α的能力与正常人相比明显减弱,结果与上述文献报道的CHB病人外周血中pDCs功能受损一致。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在患者肝脏以及血液中大量存在,推测其可能在HBV感染慢性化过程中扮演了重要的角色。为明确HBsAg参与影响了外周血免疫细胞产生干扰素的功能,在体外实验中用自病人血浆纯化的HBsAg预处理正常人的PBMCs,再经TLR7配体Gardiquimod或TLR9配体CpG A刺激,发现PBMCs产生IFN-α的能力较未作HBsAg预处理时明显降低,推测HBsAg抑制了PBMCs中pDCs分泌IFN-α的能力。然而当用HBsAg预处理自正常人纯化的pDCs,发现HBsAg并不能抑制TLR7和TLR9介导的IFN-α的产生。上述结果表明HBsAg可能通过PBMCs中的某些细胞或细胞因子作用于pDCs,从而间接抑制了IFN-α的分泌。为证实上述假设,本研究进一步探讨了HBsAg间接抑制pDCs IFN-α产生的可能途径。鉴于单核细胞在外周血中占有较高比例并为重要的抗原提呈细胞,磁珠分选单核细胞和pDCs,将单核细胞与pDCs以一定比例共孵育,经HBsAg预处理及CpG A刺激,发现单核细胞能够明显加强HBsAg对pDCs IFN-α产生的抑制作用,且随着单核细胞数量的增加,HBsAg抑制IFN-α产生的现象也更加明显。此外,HBsAg基本不能抑制剔除单核细胞的PBMCs中IFN-α产生的作用,提示单核细胞在HBsAg抑制pDCs IFN-α分泌中发挥了关键作用。为进一步明确单核细胞对pDCs的作用途径是通过细胞与细胞之间的直接接触作用或是通过分泌细胞因子间接作用,采用transwell小室将单核细胞和pDCs分隔开,重复HBsAg处理及CpG A刺激后pDCs IFN-α的分泌情况。结果显示单核细胞和pDCs分隔开后,HBsAg仍然能够明显抑制pDCs中IFN-α产生,提示单核细胞通过分泌某些细胞因子来影响间接影响pDCs的功能。鉴于TFN-α(Tumor necrosis factor-α)和IL-10 (Interleukin-10)为单核细胞分泌的重要细胞因子,且已有报道TFN-α和IL-10能够抑制pDCs IFN-α产生,检测了存在HBsAg抑制IFN-α产生现象的pDCs和单核细胞共孵育体系、PBMCs以及不存在抑制现象的pDCs上清中TNF-α、IL-10的分泌情况,结果显示经HBsAg预处理的PBMCs及pDCs和单核细胞共孵育组中TNF-α的分泌显著升高,单纯pDCs组并未见显著升高。而在体外用HBsAg处理纯化的单核细胞,发现HBsAg能够以剂量依赖的方式诱导单核细胞分泌TNF-α、IL-10。同时,在剔除单核细胞的PBMCs中,HBsAg则基本不能诱导这两种细胞因子的分泌,进一步确认TNF-α和IL-10主要是由单核细胞所分泌。为确认TNF-α和IL-10对pDC功能的抑制作用,在体外向PBMCs中外源性添加TNF-α、IL-10,发现这两种细胞因子能够不同程度地抑制PBMCs和pDCs IFN-α产生。进一步的细胞因子中和抗体实验发现,经TNF-α和IL-10的中和抗体预处理后,HBsAg对于IFN-α产生的抑制作用明显减弱。上述结果证实由单核细胞分泌的TNF-α和IL-10在介导HBsAg抑制pDCs产生IFN-α中发挥了关键作用。为了解释TNF-α和IL-10对pDCs分泌IFN-α功能的抑制作用,初步探讨了TNF-α和IL-10对pDCs中TLR9介导IFN-α生成信号通路的影响。研究结果显示,TNF-α和IL-10可下调pDCs中TLR9受体的表达,推测可能是TNF-α和IL-10抑制IFN-α产生的机制之一综上所述,本研究证实乙肝表面抗原可以抑制外周血pDCs分泌IFN-α,并且这种抑制作用由乙肝表面抗原诱导单核细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-10所介导,而下调pDCs中TLR9受体的表达可能为两种细胞因子抑制pDCs中IFN-α产生的机制之一。本研究结果可能部分诠释乙肝病毒感染慢性化的机理,即乙肝病毒利用HBsAg钝化天然免疫系统而建立慢性持续性感染,还为探索慢性乙肝免疫治疗的新方法提供了新的理论基础和实验依据。