背景:肺癌是常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率均居首位,5年生存率约为15%。目前治疗的主要手段仍然是化疗,尽管化疗方案大多采用不同作用机制药物的联合治疗,但由于肺癌细胞容易产生对化疗药物的耐药性,常常会导致化疗失败。肿瘤的耐药机制十分复杂。肿瘤细胞生存通路PI3K-AKT表达上调是引起肺癌耐药的一个重要因素。研究发现,肿瘤微环境中的基质细胞可以分泌多种细胞因子促进肿瘤细胞PI3K-AKT表达上调,导致细胞耐药。然而,目前临床上单一应用这些通路相关蛋白抑制剂疗效差或无持续疗效,提示联合多种不同作用靶向药物或进一步寻找通路关键节点都有可能治疗肿瘤。肿瘤微环境在以下情况可产生内质网应激,如缺氧、低糖、酸中毒等。持久的应激可以诱发未折叠蛋白反应(UPR),使细胞内内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达增多。GRP78参与多种肿瘤的耐药并成为肿瘤治疗的新靶点。有研究表明PI3K/AKT信号通路参与了UPR调控,尽管在其激活或者抑制UPR的调控结果上存在争议。另外,抑制PI3K的激活已被证明能下调肝细胞癌GRP78表达,提示促生存通路可调控内质网应激蛋白表达。但是,在肺癌细胞,PI3K-AKT通路的激活是否参与GRP78表达尚无研究。研究肿瘤微环境对肿瘤细胞和其介导的信号转导通路的变化要求构建一个能模拟体内微环境的多细胞联合培养模式。传统的细胞培养方法不仅步骤复杂、实验耗时较长,消耗材料较多,灵敏度也欠佳;而基于微流控芯片的细胞培养平台,不仅克服了传统方法的上述缺点,还具有高通量、集成化、快速检测和消耗试剂少等优势。由于微流控芯片各组件的大小依据细胞培养及生长所需的空间设计,因此二者可相互匹配,有利于操纵和分析细胞;而且,芯片微通道的多维空间及网络结构相对封闭,这又与生理状态下细胞生存的空间环境特征相接近,以上特点决定了微流控芯片在三维细胞培养方面有很大优势。因此,在本研究中我们利用微流控芯片这一新兴的技术平台,进行肿瘤微环境介导的肺癌细胞化疗耐药机制研究:以非直接接触的方式共培养肺癌细胞与肺成纤维细胞,并观察肺癌a549细胞pi3k-akt信号转导通路和grp78蛋白表达的变化,探索间质细胞参与肿瘤化疗耐药性研究,以期为肺癌的治疗提供新的靶点以及为联合治疗方案的设计提供帮助。研究内容:1、三维微流控芯片细胞共培养检测平台的设计与制作。依据体内细胞之间、细胞与药物之间、细胞与培养介质之间相互作用的特性,结合流体力学原理以及实验设计的平行对照原则,设计并制作了一个双层、多单元集成、多通道连接的高通量微流控芯片实验室,以满足联合三维细胞培养和药敏检测的需要。用pdms作为芯片材料,首先制作上游二维细胞培养池,并筛选出最有利于成纤维细胞培养的芯片条件,构建成纤维细胞培养体系。然后制作下游三维培养池,筛选出最有利于肺癌a549细胞培养和生长的微环境,构建下游三维细胞培养体系。上游二维培养池和下游三维培养池之间有多条微通道相连接,保证上游成纤维细胞分泌的细胞因子能够随着流动的培养基向下游区域连续供给,使下游三维培养池内的细胞连续受到上游分泌的细胞因子的影响,以非直接接触模式进行细胞共培养。2、基于微流控芯片平台研究caf介导的a549细胞pi3k-akt表达和耐药相关性分析。把a549肺癌细胞上清液加入培养基以诱导人成纤维细胞hfl-1,检测成纤维细胞经肺癌细胞诱导后α-sma蛋白的表达。将激活的hfl-1细胞(癌相关成纤维细胞/caf)置于上游二维芯片培养,a549细胞在下游三维芯片培养。在显微镜下动态观察细胞在不同培养模式下的状态。当细胞生长状态良好时,按平行对照原则,进行细胞分组培养及药物干预。采用免疫荧光细胞化学的方法检测a549细胞pi3k-akt蛋白的表达,采用hoechst33342、pi双染色法确定肺癌细胞在paclitaxel药物作用下的生存率。通过研究耐药相关蛋白的表达及细胞在化疗药物干预作用下的生存率,分析促生存通路蛋白在肺癌细胞对paclitaxel化疗耐药中的作用。3、基于微流控平台a549细胞grp78蛋白表达及与pi3k-akt通路激活相关性研究。在三维细胞培养体系中,采用免疫荧光细胞化学的方法检测a549肺癌细胞grp78蛋白的表达。在加入pi3k-akt通路蛋白抑制剂分组药物干预后,采用免疫荧光细胞化学的方法检测a549细胞grp78蛋白的表达。hoechst33342、pi双染色法确定肺癌细胞在paclitaxel及/或通路蛋白抑制剂、grp78抑制剂等药物作用下的生存率,明确成纤维细胞诱导的促生存通路及urp通路表达在促进肺癌细胞生存及耐药中的作用。4、基于微流控平台的细胞因子检测。将激活的肺成纤维细胞hfl1置于二维细胞培养体系中培养6小时,在培养液出口处收集不同时间点的上清液,采用elisa的方法检测上清液中分泌的细胞生长因子(hgf)水平。通过芯片平台,检测肺癌a549细胞met磷酸化水平及pi3k-akt表达变化。应用外源性hgf纯品作用于肺癌a549细胞后,观察上述指标,以检验成纤维细胞对肺癌细胞的影响可能是由hgf介导的。结果:1、微流控芯片细胞共培养检测平台的构建。依据体内细胞之间、细胞与药物之间、细胞与培养介质之间相互作用的特性,结合流体力学原理以及实验设计的平行对照原则,设计并制作了一个双层、多单元集成、多通道连接的高通量微流控芯片实验室,以满足联合三维细胞培养和药敏检测的需要。①在上层芯片上设计4个适合hfl-1细胞生长的平行的细胞培养池,使细胞能够贴壁生长,产生的细胞因子可随流动介质注入下层培养池。②下层芯片包括4个平行的检测单元,每个检测单元包括三维的a549细胞培养池和其上游浓度发生器。细胞培养池灌注方式为培养基侧流,共同的浓度发生器可以生成四个特定的浓度,顶端液池为加药池。在实际操作中,可以加入与药物分子量相近的荧光分子进行表征,通过测定不同培养池中的荧光强度值,可以得到实际的浓度比。③上下层芯片之间微通道的设计,能够允许hfl-1细胞分泌的细胞因子及培养基通过,激活的hfl-1细胞分泌的细胞因子可以渗透入三维基质胶里作用于a549细胞。结果表明:微流控芯片可通过非直接接触的细胞共培养,有效地分析癌相关成纤维细胞分泌液对肺癌细胞促生存的作用。该微流控芯片体系通过注射泵驱动芯片通道内液体的流动,使细胞培养始终处于流动介质环境中。和传统细胞培养相比,该体系可以模拟体内生理条件下血液的流动及对细胞营养物质的供应,更接近体内的动态微环境。2、微流控芯片三维共培养的a549细胞活力增强与pi3k-akt上调有关。免疫荧光结果显示:在加入肺癌a549细胞上清液的培养基中,hfl-1表达α-sma显著增高,后者是成纤维细胞激活(癌相关成纤维细胞/caf)的主要标志。在芯片动态流动介质条件下的细胞培养结果显示,上游的激活的hfl-1细胞均有良好贴壁,生长状态较好。下游的a549细胞在基质胶里生长状态好,伸展正常。在化疗药物paclitaxel作用下,共培养的a549细胞细胞凋亡率降低。三维培养的a549细胞检测中,免疫荧光结果显示在激活的hfl-1细胞的诱导下,a549细胞pi3k、akt的表达均显著增高。应用pi3k/akt抑制剂能明显增加a549细胞凋亡,提示促生存通路的激活与肿瘤细胞抗凋亡能力增强有关。3、grp78介导的a549细胞耐药与上调的pi3k-akt信号转导有关。免疫荧光结果显示在激活的hfl-1细胞的诱导下,a549细胞pi3k、akt、grp78的表达均显著增高。应用pi3k/akt抑制剂导致grp78表达降低。相反,应用grp78抑制剂对pi3k/akt表达无影响,提示grp78可能位于pi3k/akt下游。grp78功能抑制剂可促进a549细胞凋亡,提示共培养条件下诱导的grp78升高,通过抑制a549细胞凋亡而导致肺癌细胞耐药。pi3k/akt抑制剂与grp78抑制剂有协同作用。4、caf介导的肺癌a549细胞grp78表达上调依赖于hgf/met途径。成纤维细胞株hfl-1细胞(caf)分泌hgf因子明显增多。应用外源性hgf因子纯品作用于三维培养的a549细胞后,细胞内met、pi3k、akt和grp78的表达明显增高。met抑制剂可以抑制pi3k、akt的表达,表明caf对a549细胞生存通路PI3K-AKT的影响可能是由HGF介导的。Met抑制剂和PI3K/AKT抑制剂均可使GRP78的表达有明显降低。应用Met抑制剂和PI3K/AKT抑制剂均增加A549细胞凋亡,进一步提示促生存通路的激活与肿瘤细胞抗凋亡能力增强有关。结论:1、双层、多单元集成、多通道高通量微流控梯度芯片实验室可以进行近体内生理环境条件下的肿瘤细胞与成纤维细胞非接触共培养、药物刺激、内含物及信号转导通路分析,可用于肿瘤微环境介导的肿瘤细胞耐药研究。2、癌相关成纤维细胞可引起A549细胞促生存通路PI3K-AKT信号转导通路表达上调,导致A549细胞对化疗药物的耐药。3、GRP78位于PI3K-AKT信号转导通路下游,提示促生存通路与内质网应激通路存在交联。PI3K/AKT抑制剂与GRP78抑制剂有协同促进A549细胞凋亡作用。4、激活的HFL-1细胞通过分泌HGF促使PI3K-AKT信号通路上调和内质网应激蛋白GRP78表达。