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目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是长期大量饮酒所致的肝脏损害性病变,其病理改变包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。关于ALD的发病机理目前尚不清楚,近年来有人提出以氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说,“第一次打击”使脂类沉积在肝细胞,导致脂肪肝,“第二次打击”涉及内毒素、细胞因子参与的氧化应激和脂质过氧化。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是合成一氧化氮(nitric oxide, NO)的一种关键酶,目前发现至少有3种亚型,分别为诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS),内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS, eNOS)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS, nNOS)。其中与肝脏疾病有关的主要为iNOS和eNOS。在生理状态下,肝组织中主要表达eNOS,而iNOS无表达或仅有较少表达。当肝组织受损时,肝细胞则大量表达iNOS,催化产生大量的NO。NO在大量活性氧存在的条件下,与超氧阴离子(superoxide anion, O2-)快速反应生成过氧化亚硝酸盐(peroxynitrite, ONOO-),后者能够硝化蛋白质酪氨酸,生成硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT),从而影响细胞的能量和脂质代谢以及细胞的增殖、分化与凋亡。本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)的方法观察NT、iNOS及iNOS mRNA的表达情况,探讨iNOS在ALD发病过程的表达及意义,为有效防治ALD提供新的思路。方法:选用雄性健康清洁级Wister大鼠50只,体重200±20g,正常饲养1周后随机分出10只为正常对照组,其余动物采用逐渐增加酒精浓度(浓度30%-60%,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法酒精灌胃,分别于4周、8周、12周和16周末随机处死动物8只、8只、8只和9只,留取血清及肝组织标本并制备10%的肝匀浆,应用日本OLYMPUS AU 600全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT),天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST )和乙酰胆碱酯酶( cholinesterase, CHE);应用比色法检测肝匀浆肝组织蛋白含量,以g(mg)为单位分别测定肝匀浆甘油三酯(triglyceride, TG)、氧自由基(oxygen free radical, OFR)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的含量;取部分肝组织立即冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,观察肝细胞脂肪变性情况;另取肝组织固定于4%中性福尔马林溶液,石蜡包埋,5μm切片行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肝组织的普通病理改变,天狼红染色观察肝组织纤维化程度;并用石蜡切片进行iNOS、NT免疫组织化学染色,观察肝组织iNOS、NT的表达情况;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用RT-PCR观察大鼠肝组织iNOS mRNA的表达。结果:1血清生化指标的变化:随着造模时间的延长,血清ALT和AST逐渐升高,CHE逐渐降低,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。2肝组织匀浆氧化应激指标的变化:随着造模时间的延长,肝组织匀浆TG、OFR及MDA含量逐渐升高,SOD含量逐渐降低,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。3肝组织病理学改变:4周大鼠肝细胞出现小叶中央静脉周围肝细胞脂肪变性,随着造模时间的延长,肝细胞脂肪变性逐渐加重,肝小叶内坏死灶明显增多和纤维组织增生,16周大鼠肝细胞呈现弥漫微囊泡样脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成。冰冻切片苏丹Ⅳ染色显示正常对照组大鼠肝组织无脂肪变性,模型4周组大鼠肝细胞胞浆中出现少量红色脂滴,随着造模时间延长,红色脂滴逐渐增多,至16周表现为大量红色脂滴分布于肝细胞内。天狼红染色显示模型4周组大鼠肝组织无明显纤维组织增生,模型12周组大鼠肝组织出现明显窦周纤维化和纤维化间隔形成趋势,模型16周组大鼠肝组织出现明显纤维间隔。4免疫组化法检测大鼠肝组织iNOS及NT的表达:光镜下,正常对照组大鼠肝组织内仅有少量iNOS及NT表达,随着造模时间的延长阳性表达逐渐增强,主要表达于肝细胞胞浆内。与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。5 RT-PCR法检测iNOS mRNA的表达量:正常对照组大鼠肝组织中仅表达少量iNOS mRNA,随着造模时间的延长表达量逐渐增加,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。6肝组织中NT的表达量与iNOS mRNA表达水平呈正比,相关系数为0.71,P<0.01。7肝组织中NT表达量与血清AST水平呈正相关,相关系数为0.65,P<0.01,与CHE呈负相关,相关系数为-0.54,P<0.01。8肝组织中NT的相对表达量与肝匀浆中OFR和MDA的含量呈正相关,相关系数分别为0.84和0.82,P值均<0.01,与SOD呈负相关,相关系数为-0.69,P<0.01。9肝组织中iNOS mRNA的相对表达量与血清AST水平呈正相关,相关系数为0.42,P<0.01,与CHE呈负相关,相关系数为-0.52,P<0.01。10肝组织中iNOS mRNA的相对表达量与肝匀浆中氧化指标OFR和MDA的含量呈正相关,相关系数分别为0.57和0.66,P值均<0.01,与抗氧化指标SOD呈负相关,相关系数为-0.46,P<0.01。结论:1应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠ALD模型,该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床ALD的基本病变。2 iNOS表达增强所致的硝化应激与氧化应激关系密切,共同参与ALD的发病。