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癌症是威胁人类生命健康的主要疾病之一。临床上癌症的治疗手段主要有手术治疗，化疗，放疗和免疫治疗等。其中化疗是主要的方式之一。但肿瘤的发生发展往往具有很多复杂的特性，从而使单一的化疗手段并不能达到最佳治疗效果。目前，多种治疗手段协同抗肿瘤的治疗方法显示了优越的发展前景。紫杉醇在临床中广泛用于治疗多种癌症，如乳腺癌，子宫癌和肺癌等，但其低水溶性，选择性差等特性限制了其疗效，并造成了严重的毒副作用，目前多采用纳米制剂手段，包裹紫杉醇用于癌症化疗，如制备成脂质体，胶束等。化学动力疗法是一种利用芬顿反应产生具有高毒性的活性氧（羟基自由基）来杀伤肿瘤细胞的一种治疗手段。因此，可应用化疗联合化学动力治疗，实现多模式协同治疗癌症，来达到最佳的治疗效果。
综上所述，本课题设计了一种纳米载药系统，用于实现癌症的化疗和化学动力协同治疗。选用脂质体作为载体，脂质体是一种具有双层膜结构的纳米粒，可以同时包载水溶性和油溶性的药物，且具有好的生物相容性。首先为了实现紫杉醇的靶向递送和敏感释药，设计合成了唾液酸(SA)修饰的含有聚乙二醇亲水链(PEG)和二硫键（-SS-）的谷胱甘肽(GSH)敏感的两亲性紫杉醇(PTX)前药PTX-SS-PEG-SA，其中唾液酸用来靶向肿瘤部位高表达的E一选择素。之后以PTX-SS-PEG-SA，卵磷脂，胆固醇为膜材，同时包裹水溶性纳米四氧化三铁(Fe3O4)和葡萄糖氧化酶(GOD)，制备了一种新型的脂质体纳米反应器。该纳米粒可在唾液酸作用下靶向肿瘤组织，到达肿瘤后，在高浓度的GSH作用下，二硫键断裂，释放紫杉醇，达到化疗作用;同时脂质体解体，水腔中包裹的葡萄糖氧化酶和四氧化三铁被释放，葡萄糖氧化酶催化肿瘤部位过量的葡萄糖产生过氧化氢(H2O2)，产生的过氧化氢在Fe2/3+作用下发生芬顿反应生成羟基自由基(OH)，杀死肿瘤细胞。该体系可实现化疗和化学动力协同治疗，实现更好的抗肿瘤效果。课题研究主要包括以下四部分内容:1.含有二硫键的紫杉醇前药的合成及表征
首先将PTX与二硫代二丙酸酐(DTDPA)反应，得到具有二硫键修饰的羧基化的紫杉醇前药PTX-SS-COOH。之后PTX-SS-COOH与mPEG-NH2通过酰胺反应得到不具备靶向性紫杉醇前药，PTX-SS-mPEG。同时PTX-SS-COOH与NH2-PEG-NH2，SA通过两步酰胺反应得到具有靶向性的紫杉醇前药，PTX-SS-PEG-SA。合成的产物通过1H-NMR，FT-IR和MS表征，验证成功合成。
2.共载药脂质体纳米反应器的制备及表征
采用薄膜水化法制备脂质体。通过单因素考察法确定脂质体的最优处方，并制备得到共载紫杉醇前药，Fe3O4和GOD的脂质体——Fe/G@T-lipos(PTX-SS-PEG-SA修饰，T表示具有靶向性)和Fe/G@N-lipos（PTX-SS-mPEG修饰，N表示无靶向性）。对脂质体的粒径分布及Zeta电位，表面形态进行了表征。进一步确定了共载药脂质体中各成分的载药量，并验证了其体外进行芬顿反应的行为和体外释放PTX的行为。
实验结果显示:共载药脂质体粒径分布均匀，外观形态良好，呈圆球形。脂质体中PTX载药量分别为(9.38±0.03)％(Fe/G@N-lipos)和(7.52±0.01)％(Fe/G@T-lipos);Fe3O4载药量分别为(1.66±0.02)％(Fe/G@N-lipos)和(1.87±0.02)％(Fe/G@T-lipos);GOD载药量分别为(21.16±0.09)％(Fe/G@N-lipos)和(19.67±0.13)％(Fe/G@T-lipos)。共载药脂质体可在体外进行芬顿反应，使亚甲蓝在600-700nm处的吸收峰消失。其体外释放紫杉醇的行为呈现出氧化还原敏感性，在含有20mMDTT的释放介质中，96h内分别释放了83.98％(Fe/G@N-lipos)，66.47％(Fe/G@T-lipos)，而无DTT的释放介质中，相同时间分别仅释放了33.52％(Fe/G@N-lipos)和32.96％(Fe/G@T-lipos)。
3.共载药脂质体纳米反应器的体外评价
选择Hela细胞和B16细胞作为细胞模型，首先采用MTT法考察了共载药脂质体的细胞毒作用;以香豆素-6作为荧光物质，验证两种细胞对共载药脂质体的摄取作用;进一步验证了SA的主动靶向作用;使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒验证共载药脂质体的凋亡诱导能力;使用活性氧检测试剂盒验证共载药脂质体的进行芬顿反应产生活性氧的能力;最后使用细胞周期试剂盒检测了紫杉醇的细胞周期阻滞作用。
实验结果显示:共载药脂质体通过协同疗法具有最高的细胞毒作用;脂质体的体外摄取要高于游离的香豆素-6，且具有SA修饰的靶向脂质体在Hela细胞中表现出明显的细胞主动靶向作用;共载药脂质体能明显诱导细胞凋亡，作用效果高于游离紫杉醇;活性氧检测结果显示共载药脂质体可通过芬顿反应产生活性氧;同时，细胞周期实验结果表明共载药脂质体制剂可使细胞周期G2/M期阻滞。
4.共载药脂质体纳米反应器的体内抑瘤活性评价
建立小鼠荷B16黑色素瘤肿瘤模型，首先将荧光物质Dir作为荧光染料包封于载有PTX-SS-PEG-SA的脂质体中，得到具有靶向性的Dir修饰的制剂Dir@T-lipos，进行活体与离体组织成像，评价脂质体在体内的靶向效果。之后进行了体内抗肿瘤评价，通过尾静脉分别注射生理盐水、Taxol与共载药脂质体制剂，以荷瘤小鼠瘤体积与体重为指标评价共载药脂质体的体内抗肿瘤活性与体内安全性。治疗结束后，将各组小鼠的正常器官与肿瘤剥离后，进行H&E染色，观察制剂的体内各脏器毒性。
实验结果显示，与游离对照组相比，Dir@T-lipos组在体内具有明显的肿瘤靶向性，并且处死小鼠后，离体与在体显示出相同的成像结果。从抑瘤效果来看，与生理盐水组相比，Taxol治疗组与脂质体治疗组均表现出明显的抗肿瘤作用。其中Fe/G@T-lipos因其体内靶向的作用，表现出了最优的治疗效果。Taxol治疗组的小鼠体重略有下降，而共载药脂质体治疗组和生理盐水组小鼠的体重上升，说明与Taxol相比，脂质体的毒副作用较小。H&E结果表明，生理盐水组与脂质体治疗组小鼠各器官组织均正常，而Taxol治疗组小鼠表现出一定的器官损伤，进一步证明了共载药脂质体有着较好的体内安全性。
综上所述，本课题设计了一种纳米载药系统，用于实现癌症的化疗和化学动力协同治疗。选用脂质体作为载体，脂质体是一种具有双层膜结构的纳米粒，可以同时包载水溶性和油溶性的药物，且具有好的生物相容性。首先为了实现紫杉醇的靶向递送和敏感释药，设计合成了唾液酸(SA)修饰的含有聚乙二醇亲水链(PEG)和二硫键（-SS-）的谷胱甘肽(GSH)敏感的两亲性紫杉醇(PTX)前药PTX-SS-PEG-SA，其中唾液酸用来靶向肿瘤部位高表达的E一选择素。之后以PTX-SS-PEG-SA，卵磷脂，胆固醇为膜材，同时包裹水溶性纳米四氧化三铁(Fe3O4)和葡萄糖氧化酶(GOD)，制备了一种新型的脂质体纳米反应器。该纳米粒可在唾液酸作用下靶向肿瘤组织，到达肿瘤后，在高浓度的GSH作用下，二硫键断裂，释放紫杉醇，达到化疗作用;同时脂质体解体，水腔中包裹的葡萄糖氧化酶和四氧化三铁被释放，葡萄糖氧化酶催化肿瘤部位过量的葡萄糖产生过氧化氢(H2O2)，产生的过氧化氢在Fe2/3+作用下发生芬顿反应生成羟基自由基(OH)，杀死肿瘤细胞。该体系可实现化疗和化学动力协同治疗，实现更好的抗肿瘤效果。课题研究主要包括以下四部分内容:1.含有二硫键的紫杉醇前药的合成及表征
首先将PTX与二硫代二丙酸酐(DTDPA)反应，得到具有二硫键修饰的羧基化的紫杉醇前药PTX-SS-COOH。之后PTX-SS-COOH与mPEG-NH2通过酰胺反应得到不具备靶向性紫杉醇前药，PTX-SS-mPEG。同时PTX-SS-COOH与NH2-PEG-NH2，SA通过两步酰胺反应得到具有靶向性的紫杉醇前药，PTX-SS-PEG-SA。合成的产物通过1H-NMR，FT-IR和MS表征，验证成功合成。
2.共载药脂质体纳米反应器的制备及表征
采用薄膜水化法制备脂质体。通过单因素考察法确定脂质体的最优处方，并制备得到共载紫杉醇前药，Fe3O4和GOD的脂质体——Fe/G@T-lipos(PTX-SS-PEG-SA修饰，T表示具有靶向性)和Fe/G@N-lipos（PTX-SS-mPEG修饰，N表示无靶向性）。对脂质体的粒径分布及Zeta电位，表面形态进行了表征。进一步确定了共载药脂质体中各成分的载药量，并验证了其体外进行芬顿反应的行为和体外释放PTX的行为。
实验结果显示:共载药脂质体粒径分布均匀，外观形态良好，呈圆球形。脂质体中PTX载药量分别为(9.38±0.03)％(Fe/G@N-lipos)和(7.52±0.01)％(Fe/G@T-lipos);Fe3O4载药量分别为(1.66±0.02)％(Fe/G@N-lipos)和(1.87±0.02)％(Fe/G@T-lipos);GOD载药量分别为(21.16±0.09)％(Fe/G@N-lipos)和(19.67±0.13)％(Fe/G@T-lipos)。共载药脂质体可在体外进行芬顿反应，使亚甲蓝在600-700nm处的吸收峰消失。其体外释放紫杉醇的行为呈现出氧化还原敏感性，在含有20mMDTT的释放介质中，96h内分别释放了83.98％(Fe/G@N-lipos)，66.47％(Fe/G@T-lipos)，而无DTT的释放介质中，相同时间分别仅释放了33.52％(Fe/G@N-lipos)和32.96％(Fe/G@T-lipos)。
3.共载药脂质体纳米反应器的体外评价
选择Hela细胞和B16细胞作为细胞模型，首先采用MTT法考察了共载药脂质体的细胞毒作用;以香豆素-6作为荧光物质，验证两种细胞对共载药脂质体的摄取作用;进一步验证了SA的主动靶向作用;使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒验证共载药脂质体的凋亡诱导能力;使用活性氧检测试剂盒验证共载药脂质体的进行芬顿反应产生活性氧的能力;最后使用细胞周期试剂盒检测了紫杉醇的细胞周期阻滞作用。
实验结果显示:共载药脂质体通过协同疗法具有最高的细胞毒作用;脂质体的体外摄取要高于游离的香豆素-6，且具有SA修饰的靶向脂质体在Hela细胞中表现出明显的细胞主动靶向作用;共载药脂质体能明显诱导细胞凋亡，作用效果高于游离紫杉醇;活性氧检测结果显示共载药脂质体可通过芬顿反应产生活性氧;同时，细胞周期实验结果表明共载药脂质体制剂可使细胞周期G2/M期阻滞。
4.共载药脂质体纳米反应器的体内抑瘤活性评价
建立小鼠荷B16黑色素瘤肿瘤模型，首先将荧光物质Dir作为荧光染料包封于载有PTX-SS-PEG-SA的脂质体中，得到具有靶向性的Dir修饰的制剂Dir@T-lipos，进行活体与离体组织成像，评价脂质体在体内的靶向效果。之后进行了体内抗肿瘤评价，通过尾静脉分别注射生理盐水、Taxol与共载药脂质体制剂，以荷瘤小鼠瘤体积与体重为指标评价共载药脂质体的体内抗肿瘤活性与体内安全性。治疗结束后，将各组小鼠的正常器官与肿瘤剥离后，进行H&E染色，观察制剂的体内各脏器毒性。
实验结果显示，与游离对照组相比，Dir@T-lipos组在体内具有明显的肿瘤靶向性，并且处死小鼠后，离体与在体显示出相同的成像结果。从抑瘤效果来看，与生理盐水组相比，Taxol治疗组与脂质体治疗组均表现出明显的抗肿瘤作用。其中Fe/G@T-lipos因其体内靶向的作用，表现出了最优的治疗效果。Taxol治疗组的小鼠体重略有下降，而共载药脂质体治疗组和生理盐水组小鼠的体重上升，说明与Taxol相比，脂质体的毒副作用较小。H&E结果表明，生理盐水组与脂质体治疗组小鼠各器官组织均正常，而Taxol治疗组小鼠表现出一定的器官损伤，进一步证明了共载药脂质体有着较好的体内安全性。