论文部分内容阅读
研究背景与目的胸腺对异种抗原细胞发生的免疫排斥现象,是在前期研究胸腺耐受的研究发现的。迄今为止,普遍的理论认为胸腺是一个免疫“特赦”器官。T细胞前期在胸腺内的发育和分化是一个抗原非依赖阶段,此时接触抗原易发生凋亡或耐受,当其成熟后即迁移至外周的免疫器官,在抗原诱导下产生免疫应答。因此对胸腺内可能发生的免疫机制未能受到关注。根据传统的诱导性中枢耐受的理论机制,如果T细胞发育过程中在胸腺内接触到异基因的抗原,则会被诱导出对该异基因外周移植物的耐受,同时,血-胸腺屏障使血液中的大分子物质包括外来抗原不能进入胸腺,所以胸腺内注射异基因抗原可以躲过免疫监视,诱导出对异基因供体耐受的T细胞。为更好的研究异种抗原在机体内的生物学特性及机体产生免疫耐受和免疫排斥情况,我们将人肝癌细胞Hep-3B注射到10-15天的C57BL/6小鼠的胸腺中,人肝癌细胞Hep-3B作为异种不同组织的、MHC差异较大的抗原,观察异种抗原在小鼠胸腺内的命运及对胸腺微环境的影响。研究方法1.胸腺内注射异种抗原后对胸腺重量及细胞数量的影响1) Hep-3B人肝癌细胞的传代；2)DiI染色标记；3)小鼠胸腺内注射细胞；4)小鼠胸腺组织称重及胸腺细胞绝对值计数；2.FCM分析小鼠胸腺内CD4CD8T细胞亚群的变化1)小鼠胸腺内注射；2) FCM分析胸腺内T细胞表面的CD4/CD8的比例变化；3.胸腺注射异种抗原后组织切片分析1)小鼠胸腺内注射；2)石蜡切片的制作；3) HE染色观察；研究结果第一部分DiI染色观察Hep-3B人肝癌细胞在含有20微克/毫升DiI的基本培养基中标记30min后,细胞标记成功,并发射出强烈的红色荧光。胸腺重量及胸腺总数的变化注射之后的实验组的C57BL/6小鼠胸腺的重量一直持续上升,与对照组相比,14天和21天的时候,重量差距较为明显,相对于胸腺重量的增加,7天,14天,21天的时候小鼠的胸腺细胞的数量却减少。第二部分FCM分析小鼠胸腺内CD4CD8T细胞亚群的变化注射后7天和21天的对照组和实验组对比,双阳性的CD4CD8有明显的减少,单阳性CD4和单阳性CD8、双阴性CD4CD8均有很明显的增高,特别是单阳性的增加十分明显,21天的对比,基本未有明显的差别。第三部分胸腺注射异种抗原后组织切片分析组织学分析结果发现胸腺内注射后初期,人肝癌细胞完整,一些正在进行有丝分裂,但随着时间的推移,人肝癌细胞Hep-3B周围开始聚集大量的淋巴细胞,同时,一些癌细胞开始死亡,到达21天的时候,检测不到癌细胞的存在,可以看到大量的鳞状上皮细胞,这可能与胸腺的组织结构重建有关。人肝癌细胞在小鼠胸腺内最终没有逃脱免疫细胞的攻击而发生死亡,肿瘤细胞及其残骸可能存活时间长达21天左右。研究结论1.注射异种抗原细胞之后,在小鼠胸腺内被免疫细胞攻击与清除的命运,并确定巨噬细胞及成熟的T淋巴都参与了异种抗原的免疫攻击及清除。2.注射异种抗原细胞,对小鼠胸腺内T细胞发育及各类细胞亚群比例均造成一定影响,CD4CD8双阳性细胞比例显著减小,CD4/CD8单阳性细胞比例有所上升,但随着异种抗原的免疫清除,各类细胞亚群比例又恢复正常。3.异种抗原细胞的注入,对小鼠胸腺组织造成一定的病理损伤,包括注射造成的胸腺组织机械损伤、胸腺细胞总数的减少及上皮细胞的严重增生、皮质与髓质比例的失衡等,但随着异种抗原的免疫清除,这些组织病理学变化也逐渐消失,小鼠胸腺组织也恢复正常。