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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的,是一种长期危害人类健康的疾病,同艾滋病、疟疾并列为世界三大疾病。据世界卫生组织于2013年公布的“GlobalTuberculosis Report2013”显示2012年全球有860万新发结核病病例,130多万结核病死亡病例。到目前为止,卡介苗(BCG)是唯一的被批准的结核病预防用疫苗,对儿童的保护效果很好,但是对成人的保护力是1%-80%不等,而且有人群和地区的差异。因此研发新型的高效的结核病防治疫苗是各国学者努力的重点。本研究中选用结核杆菌两种重组蛋白Ag85B和EC为抗原成份,研究铝佐剂和Poly(I∶C)佐剂对两种抗原的免疫辅助效应,并筛选出Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C)这一候选疫苗在豚鼠预防模型和潜伏感染模型上评价其保护效力和免疫治疗作用。 一、新型结核病亚单位疫苗的免疫原性评价 免疫小鼠对预期疫苗的免疫原性进行初步评价。对BALB/c小鼠后肢内侧肌肉进行注射,共注射3次,间隔10天,第3针后两周摘眼球采血,分血清,用于ELISA检测检测Ag85B蛋白和EC蛋白特异性IgG水平,同时取脾分离淋巴细胞,进行抗原特异性的IFN-γ ELISPOT检测。结果表明,Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C)组小鼠血清中抗原特异性IgG水平、分泌抗原特异性IFN-γ细胞数量均高于对照组,而且与单独给予蛋白免疫组比较也是显著增高。这表明Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C)在小鼠体内引起较高的细胞免疫和体液免疫反应,可作为候选疫苗继续进行其他相关研究。 二、新型结核病亚单位疫苗预防结核感染的评价 在豚鼠预防模型上对候选疫苗(Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C))的抗结核保护作用进行评价。主要是观察结核分支杆菌攻击后豚鼠相关脏器的病变情况及脾脏荷菌数,并和BCG的保护效果相比较。疫苗组和阴性组均免疫3次,间隔10天,BCG组仅其它组第3次免疫时免疫1针。末次免疫30天后攻毒500 CFU/ml的细菌悬液进行攻毒,0.5 ml/只,感染途径为皮下注射。攻毒41天后解剖动物。豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行安乐死,取肝脏、脾脏和肺脏进行病理检查,计算病变评分;取脾脏,研磨后接种于改良罗氏培养基上,四周后计数菌落数然后计算脾菌负荷量。结果表明,候选疫苗(Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C))不能明显减轻Mtb攻毒后豚鼠的脏器病变,也不能有效抑制Mtb在动物体内的增殖。这两项指标较生理盐水组仅略有降低,无显著性差异,而BCG组的病变指数和脾荷菌数都降低明显。说明BCG有很好的结核感染预防作用,但是候选疫苗并没有有效的保护效果,即这一疫苗不适合做预防用疫苗。 三、新型结核病亚单位疫苗对结核潜伏感染治疗的评价 动物感染Mtb成功后,给予异烟肼化学治疗使动物处于潜伏感染状态,然后再用候选疫苗进行治疗,主要观察豚鼠体重、相关脏器的病变情况及脾、肺荷菌数变化情况,以评价Poly(I∶C)佐剂在感染后治疗中的免疫刺激效应。经腹股沟皮下感染Mtb单细胞悬液,5000 CFU/0.5 ml/只。皮试确定感染成功后,用异烟肼灌胃治疗,10 mg/0.5 ml/只,每周一、三、五给药,共给药4周。化学治疗结束后分组,用疫苗治疗,均为大腿肌肉给药,治疗6次,间隔时间为10天。末次治疗后4周进行解剖。解剖前对豚鼠体重进行称量,以观察疫苗对体重是否有影响,然后对豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行安乐死,取肝脏、脾脏和肺脏进行病理检查,计算病变评分;取脾脏和肺,研磨后接种于改良罗氏培养基上,四周后计数菌落数然后计算脾、肺菌负荷量。结果表明,候选疫苗(Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C))可以显著的降低豚鼠的肝、脾、肺等器官的病变程度,且能显著降低脾、肺的荷菌量。说明该疫苗对Mtb的潜伏感染有一定的治疗作用。