精子因为能够传递遗传信息到子代而至关重要。精子分化发生在睾丸,是体内最精妙复杂的细胞分化过程之一,包括精原细胞增殖、精母细胞的减数分裂以及精子细胞形态的变化。这些过程并不是生殖细胞自主发生的,而是需要睾丸中生殖细胞和体细胞之间的密切相互作用。据估计,10%-15%的育龄夫妇存在生殖障碍,而男性不育因素导致的不孕不育占50%以上。其中,精子发生障碍导致了少、弱、畸形精子症和无精子症。造成男性不育的因素很多,但不育症的具体发病机制仍知之甚少,因此无法得到有效诊断及可用的治疗方案。尽管近年来取得了一定的进展,然而,由于缺乏合适的体外精子研究模型,分子层面的不育症发病机制研究和药物筛选仍非常困难。能够模拟体内器官发育和功能的类器官技术发展迅猛,极大地促进了机制研究和药物筛选,在生物医学研究和药物研发中的应用越来越广泛。但至今为止还没有真正能重现体内精子发生过程的睾丸类器官,无法获得具有功能的精子细胞。针对以上问题,我们对体外睾丸类器官的建立开展研究工作。首先,我们通过筛选三维材料和优化培养方法,最终采用琼脂块培养及精原干细胞培养液（SSCM）与睾丸分化液（TC）组合培养的策略,率先建立了由新生小鼠睾丸细胞重聚培养而来的睾丸类器官。该类器官能模拟体内精子分化过程,并能产生具有功能的精子细胞。与此同时,我们利用单细胞转录组测序,首次绘制了睾丸类器官图谱,揭示了睾丸类器官精子发育轨迹与体内比较一致,进而从分子层面表明了睾丸类器官能够重现体内精子发生过程。随后,我们发现睾丸类器官虽然能够产生有功能的精子细胞,但分化效率偏低。为了探究造成体外精子分化效率低的原因,我们利用单细胞转录组分析比较睾丸类器官与体内睾丸的差异。在解析睾丸类器官的细胞类型时,我们发现体外存在大量的纤维细胞。进一步分析发现纤维细胞产生了过量的胶原蛋白并且造成纤维化,破坏了睾丸类器官微环境的稳态,促进生殖细胞和体细胞的凋亡。另外,单细胞转录组分析也揭示了睾丸类器官中血睾屏障的缺陷,从而影响精子分化。最后,我们以纤维化表型为靶点开展小分子化合物筛选,全面系统地优化睾丸类器官的培养。由此筛选到小分子药物吡非尼酮（PFD）能够显著降低类器官中的胶原蛋白,减少精母细胞的凋亡,提高单倍体分化效率。继而我们将小分子PFD应用于体外人的睾丸组织培养,同样可减少培养过程中产生的胶原蛋白。综上所述,本研究首次建立能够重现体内精子发生过程及产生功能单倍体的睾丸类器官,为生殖细胞发育和不育症机制研究提供重要的技术平台。此外,以纤维化为靶点进行小分子药物的筛选不仅为治疗睾丸纤维化的药物研发铺垫了基础,还为人类睾丸类器官的建立提供了理论依据。此外,我们还利用单细胞RNA测序技术分析了体内的精原干细胞并找到新的的特征基因Hhex。通过体外精原干细胞系敲低实验及转录组比较证明Hhex通过调控细胞周期和凋亡影响精原干细胞增殖,为将来人的精原干细胞的建立提供了理论基础。