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宿主防御新生隐球菌感染是由活化的巨噬细胞、NK细胞和T细胞共同作用完成的。肺泡巨噬细胞和树突状细胞(DC)一般被认为是新生隐球菌感染的一线天然屏障。宿主感染新生隐球菌后,这些DC和巨噬细胞吞食并破坏侵入的隐球菌,向T细胞提呈隐球菌抗原,并产生启动和引导适应性免疫应答的介质(细胞因子和趋化因子)。研究证明,肺脏DC和肺泡巨噬细胞的耗竭导致了感染新生隐球菌的小鼠病情迅速恶化和死亡。因此,肺泡巨噬细胞和树突状细胞在抗新生隐球菌免疫反应中起着重要的作用,并在新生隐球菌感染过程中连接先天免疫系统和适应性免疫系统。IL-17作为Th17型细胞主要代表之一,在细胞外的细菌和真菌感染的清除中起着重要的作用。增加IL-17的产生与减少隐球菌负荷有关,表明IL-17在产生保护性抗隐球菌免疫应答方面也有重要作用。CCL7,也称单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)由于其强大的趋化作用,在许多病理机制中都有涉及。然而,其被IL-17调制,却很少受到关注。在本研究中,我们以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为研究对象,证明了在新生隐球菌感染巨噬细胞中IL-17可介导CCL7的诱发。并且,这种效应是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路介导,导致CCL7表达增加。了解CCL7表达的调控可以为新生隐球菌感染免疫潜在治疗靶点的发展提供见解。第一部分:隐球菌脑膜炎患者外周血单个核细胞中IL-17表达降低本部分将探讨患者外周血单个核细胞中IL-17的表达情况。纳入上海长海医院和长征医院2008年5月~2016年8月患者28例,并且收集同时期健康对照者30例。分别分离其外周血单个核细胞,采用实时定量PCR检测其IL-17表达量。结果显示,与健康对照组相比,患者外周血单个核细胞中IL-17mRNA表达水平明显降低。实验室培养RAW264.7细胞至对数生长期,用热灭活新生隐球菌刺激RAW264.7细胞,分别在刺激后的0、4、8、12小时后收集细胞和上清,进行RT-PCR和ELISA检测IL-17在基因和蛋白层面的表达。结果表明,热灭活新生隐球菌与巨噬细胞系共培养后,IL-17 mRNA和蛋白的表达均呈时间依赖性增高,在12小时达到最高。本部分结果提示,IL-17可能通过影响新生隐球菌免疫应答而参与到发病机制中。第二部分:巨噬细胞抗隐球菌感染免疫过程中MAPK/CCL7表达升高本部分将探讨MAPK代表蛋白/CCL7在巨噬细胞抗新生隐球菌感染免疫中的表达。实验室培养RAW264.7细胞,待呈对数增长后与热灭活新生隐球菌共培养12小时后收集上清,同时设立对照组,采用实时荧光定量PCR及ELISA检测CCL7在基因和蛋白层面的表达水平。并用western blotting检测实验组与对照组分别培养0、8、12小时后巨噬细胞中MAPK的代表蛋白的表达水平。再分别用MAPK的代表蛋白ERK、JNK、p38的抑制剂预处理,检测热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7的表达,结果发现,与对照组相比,热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7表达明显升高(P<0.05),并且巨噬细胞中MAPK代表蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化均增加;ERK、JNK的抑制剂预处理细胞,导致新生隐球菌感染诱导巨噬细胞表达CCL7降低,而p38的抑制剂处理巨噬细胞则没有这种现象。本部分结果提示巨噬细胞感染新生隐球菌后可以通过MAPK中的ERK、JNK信号通路来增强CCL7的产生来增强免疫。第三部分:IL-17可通过MAPK信号通路介导巨噬细胞中CCL7的表达上调本部分将探讨IL-17对新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7产生的调控机制。实验室培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,待其呈对数增长趋势时分别以不同浓度的rhIL-17(25,50以及100 ng/ml)预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1:10的比例共同孵育12小时。同时设立对照组,对照组为未加入rhIL-17预处理但与新生隐球菌以1:10的比例共孵育的等体积巨噬细胞,也即加入rhIL-17的浓度为0 ng/ml。1.不同浓度rhIL-17(0,25,50以及100 ng/ml)预处理后,ELISA检测巨噬细胞抗新生隐球菌免疫过程中CCL蛋白的表达水平;用100 ng/ml rhIL-17预处理后,并用western blotting分别检测巨噬细胞与新生隐球菌共培养0、8、12小时后ERK、p38、JNK的表达水平。2.控制实验因素,即在用rhIL-17刺激之前,分别用各自信号通路的特定抑制剂处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1:10的比例共同孵育12小时后,ELISA检测评估CCL7的表达;另一方面,在用rhIL-17刺激巨噬细胞之前,用CCL7阻断抗体处理,并与新生隐球菌以1:10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平。结果发现:1.巨噬细胞在不同浓度的IL-17(对照组0ng/ml,实验组25、50和100ng/ml)中培养12h,CCL7的表达在基因和蛋白层面都随着IL-17的浓度的升高而依次递增,在100 ng/ml时最高;而western blotting结果示:用100 ng/ml rhIL-17预处理后,巨噬细胞与新生隐球菌共培养后ERK、p38、JNK的磷酸化水平升高。2.ERK的抑制剂MEK(U0126,10μm)、JNK的抑制剂JNK(SP600125,10μm)预处理细胞,导致IL-17介导CCL7表达较对照组明显降低,p38的抑制剂p38(SB203580,10μM)却未产生明显影响。而在用rhIL-17刺激之前,用CCL7阻断抗体处理,然后以100 ng/ml rhIL-17预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1:10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平,结果示,ERK、JNK表达无明显改变。本部分结果提示:IL-17可以通过上调MAPK信号通路表达调节新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7的产生。