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前言二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF)作为一种良好的有机溶剂广泛应用于纤维、皮革、染科及制药等工业生产中，属于低毒类物质。动物实验表明，DMF可经呼吸道、皮肤和消化道等途径侵入机体，主要引起肝脏的明显损害。职业流行病学调查也表明，接触DMF的工人有明显的肝功能异常。DMF的应用范围不断扩大，接触DMF导致中毒的事件不断发生，给接触DMF作业人群带来健康安全隐患，因此预防此类职业危害的发生显得尤为重要。近年来研究发现肝细胞凋亡与各种肝病有密切关系，细胞凋亡的基因调控一直是研究热点。同时也有文献表明在50-175mM浓度范围内DMF可以诱导大鼠的成纤维细胞凋亡。但目前国内外研究未见DMF导致肝细胞凋亡及其基因调控方面的报道。本实验以正常成人肝细胞(HL-7702)为观察对象，采用吖啶橙／溴乙锭(Acridine orange／Ethidium bromide，AO／EB)染色法和流式细胞术(Flowcytometer)观察不同剂量、不同时间DMF染毒对肝细胞形态学改变和凋亡率的影响，探讨DMF染毒致肝细胞凋亡的剂量—效应关系。采用western法观察不同剂量、不同时间DMF染毒后肝细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平，探讨DMF染毒致肝细胞凋亡的机制，以上实验对进一步阐明DMF对肝细胞致毒机理有重要的意义。研究目的1．探讨不同剂量、不同时间DMF染毒致正常成人肝细胞(HL-7702)凋亡的细胞形态学改变及其剂量—效应关系。2．探讨不同剂量、不同时间DMF对正常人肝细胞(HL-7702)Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响。研究方法1．采用AO／EB荧光染色观察细胞形态学改变将处于对数生长期的肝细胞以1×10~5个／ml的密度接种于六孔板中进行细胞爬片，培养24h细胞贴壁后分别以50、100、150、200 mmol／L DMF染毒。阳性对照组加入双氧水使其终浓度为10μmol／L，其他处理同染毒组；阴性对照组加等体积的灭菌PBS缓冲液，其他处理同染毒组。染毒12h、24h之后，所有的剂量组培养基离心收集死细胞。细胞爬片用PBS洗之后4％多聚甲醛固定15min。AO／EB等体积混合后染色。染色后马上将各组细胞爬片置于荧光显微镜下观察其形态学变化，并拍摄照片。凋亡细胞核呈现为染色增强，均匀一致的圆珠状或固缩状、团块状结构；非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征，二者形态迥异。2．采用流式细胞术测定细胞的凋亡率将处于对数增长期的肝细胞制备成以5×10~5个／ml的密度接种于六孔板中，染毒剂量时间同上。参考Vemes等的方法，各染毒组细胞用0.25％的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。细胞悬液离心收集细胞，用4℃PBS清洗2次。然后将细胞重悬于200μl结合缓冲液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI(50μg／ml)，避光于室温下温育15min。加入400μl结合缓冲液，用流式细胞仪对样品进行检测。实验以早期凋亡细胞(AnnexinV+／PI-)占细胞总数的百分率表示凋亡率，结果用平均凋亡率表示。3．采用Western法测定DMF对人肝细胞相关基因表达的影响将处于对数增长期的肝细胞接种于250ml大培养瓶中。DMF处理12h之后，消化收集细胞。用Western方法测定不同剂量DMF对正常成人离体肝细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响。考虑到各次实验结果的可比性，以实验样品与内参样品灰度值相比，再与阴性对照样品灰度扫描结果的比值表示，阴性组设定为1。实验重复3次，结果以平均灰度值表示。研究结果1．二甲基甲酰胺(DMF)致人肝细胞凋亡形态学观察：1)不同剂量DMF染毒12h后，AO／EB染色可见阴性对照组无明显凋亡细胞，50mmol／L剂量组开始出现细胞形态接近正常，胞质为亮绿色，核出现固缩呈圆珠状，与正常细胞比较核质比变大的细胞。随剂量增高，染毒剂量组细胞核固缩呈圆珠状的细胞开始增多并明显高于阴性对照组，同时200mmol／L晚期凋亡细胞和死亡细胞也增多，染毒组凋亡细胞明显高于阴性对照组，阳性对照组细胞基本死亡。2)不同剂量DMF染毒24h后，AO／EB染色可见阴性对照组核呈现荧光深浅不一的结构样特征的细胞，随DMF浓度的增加，出现胞核呈均匀一致的圆珠状或固缩状、团块状结构的细胞，且核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状的细胞开始增多；阳性对照组细胞基本死亡，且细胞数量明显减少。2．DMF对人肝细胞凋亡率的影响1)不同剂量DMF染毒12h后，随着DMF染毒剂量的增加肝细胞凋亡率升高。经单因素方差分析，各组间差异有统计学意义(F=259.178，p＜0.01)。从50mmol／L剂量组到200mmol／L剂量组，凋亡率从2.59％上升到34.03％。150mmol／L剂量组、200mmol／L剂量组的凋亡率比50mmol／L剂量组凋亡率高，差异有统计学意义(p＜0.01，p＜0.01)；150mmol／L剂量组、200mmol／L剂量组的凋亡率比100mmol／L剂量组高，差异有统计学意义(p＜0.01，p＜0.01)；200mmol／L剂量组比150mmol／L剂量组高，差异有统计学意义(p＜0.01)2)不同剂量DMF染毒24h后，结果经单因素方差分析，各组间差异有统计学意义(F=8.299，p＜0.01)。从50mmol／L剂量组到200mmol／L剂量组，凋亡率从1.44％上升到8.09％。两两比较后发现，150mmol／L剂量组、200mmol／L剂量组和阴性对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)150mmol／L剂量组、200mmol／L剂量组和50mmol／L剂量组间比较差异有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)；150mmol／L剂量组、200mmol／L剂量组和100mmol／L剂量组间比较差异有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)。3．DMF对人肝细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达的影响1)不同剂量DMF染毒12h后，各组肝细胞Bax蛋白表达水平经单因素方差分析，各组之间差异无统计学意义(F=2.363，p＞0.05)。随着DMF剂量的增大，Bcl-2蛋白表达水平下降。50mmol／L、100mmol／L DMF剂量组Bcl-2蛋白表达水平与阴性对照组比较无明显变化，经单因素方差分析200mmol／L剂量组Bcl-2蛋白表达水平下降(F=656.410，p＜0.01)。2)不同剂量DMF染毒12h后，Bcl-2／Bax比值随着DMF剂量增加而下降，150mmol／L、200mmol／L剂量组该比值明显下降，200mmol／L剂量组与阴性剂量组相比较差异有显著性(F=13.792，p＜0.01)。3)不同剂量DMF染毒12h后，高剂量组(150mmol／L、200mmol／L)procaspase-3的条带较其他各组减弱，并出现新的条带，提示caspase-3切割活化增强。4)不同剂量DMF染毒24h后，可见高剂量组(150mmol／L、200mmol／L)procaspase-3条带较其他各组减弱，但未见到新的条带产生。结论1．DMF染毒后，可见HL-7702细胞发生形态学改变，随DMF剂量的增加，荧光深染核固缩的细胞增多，200mmol／L剂量组改变尤为明显，但未见时间效应。2．一定浓度的DMF可诱导正常成人离体肝细胞发生凋亡，其凋亡率有随DMF浓度的增高而升高的趋势。12h和24h染毒结果可见，随染毒时间延长，早期凋亡率未增高，而晚期凋亡和坏死细胞数目增加。3．一定浓度的DMF染毒12h可诱导正常成人离体肝细胞发生凋亡，凋亡过程中caspase-3被激活，且Bcl-2、Bax参与肝细胞凋亡的调节。但染毒24h未见到caspase-3被激活，表明DMF染毒24h后肝细胞已经逐步由早期凋亡转入晚期凋亡和坏死的过程。