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目的:本研究考察金复康口服液调控NLRP3干预A549细胞增殖和体内生长的机制研究。方法:1.炎症小体NLRP3在非小细胞肺癌细胞A549增殖中的作用及机制研究敲低(knock down,KD)A549细胞中的NLRP3和利用核因子-κB(NF-κB)的抑制剂BAY 11-7082干预;MTT法检测KD A549细胞中NLRP3及NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理A549细胞后的体外增殖影响;QRT-PCR检测KD NLRP3后NLRP3的基因表达情况;Western blotting检测KD NLRP3后NLRP3、β联蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、STAT3和NF-κB p65的蛋白表达情况,及NF-κB的抑制剂BAY 11-7082干预后NLRP3的蛋白表达和对STAT3、NF-κB p65磷酸化水平的影响;白介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)ELISA试剂盒检测BAY 11-7082处理A549细胞后上清液中IL-1β的含量变化。2.金复康口服液(JFK)干预A549非小细胞肺癌原位荷瘤裸鼠模型的体内药效实验研究利用慢病毒感染技术和嘌呤霉素加压筛选,获得稳转A549-GFP-luc细胞。在裸鼠左肺注射非小细胞肺癌A549-GFP-luc细胞悬液,建立肺癌原位荷瘤裸鼠模型,随机分组给药:模型组,JFK低剂量(30 g生药/kg/d)组,JFK高剂量(45 g生药/kg/d)组,荷瘤第3天给药处理至30天。利用小动物活体成像技术考察JFK对非小细胞肺癌A549-GFP-luc原位荷瘤裸鼠模型的体内药效情况;QRT-PCR检测肺部瘤组织中NLRP3的基因表达;Western blotting检测肺部瘤组织中NLRP3的蛋白表达;Taqman Micro RNA RT-PCR检测肺部瘤组织中mi R-155的表达;HE染色检测肺肿瘤组织病理情况;免疫组化考察肺部瘤组织中Ki67和NLRP3阳性细胞的数量。3.金复康口服液(JFK)干预非小细胞肺癌细胞A549的体外实验研究MTT法检测JFK对细胞A549的体外增殖情况;平板克隆法考察JFK对A549细胞克隆形成的影响;流式细胞仪技术检测JFK对A549细胞凋亡的影响;Western blotting检测JFK对A549细胞中β-catenin、Cyclin D1,凋亡相关蛋白Cleaved-PARP、actived-caspase 3的蛋白表达情况和对AKT、STAT3、NF-κB信号通路的影响,以及对NLRP3的构成及其下游相关炎性因子的蛋白表达情况;IL-1βELISA试剂盒检测JFK干预A549细胞后上清液中IL-1β的含量变化;Taqman Micro RNA RT-PCR检测JFK处理A549细胞后mi R-155的表达情况。4.金复康口服液的质控检测及单体干预A549细胞的实验研究利用高分辨质谱结合高效液相色谱对JFK进行成分分析及对主要成分进行含量测定。MTT法检测淫羊藿苷(Icariin,ICA)对细胞A549的体外增殖影响;Western blotting检测淫羊藿苷干预A549细胞中NLRP3、β-catenin、p21的蛋白表达的影响。结果:1.敲低非小细胞肺癌A549细胞中的NLRP3引起其基因和蛋白水平的降低。敲低NLRP3抑制了A549细胞的体外增殖,伴随着β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的下调和p21蛋白的提高,同时抑制了STAT3的蛋白表达及NF-κB的磷酸化水平。NF-κB抑制剂BAY 11-7082显著抑制A549细胞体外增殖和NLRP3的蛋白表达,伴随着STAT3和NF-κB的磷酸化水平下降及上清液中IL-1β含量的下降。2.在体内水平,JFK(30 g生药/kg/d,45 g生药/kg/d)给药干预28天后,与模型组比较,均显著抑制A549-GFP-luc肺癌原位荷瘤裸鼠模型中活体成像后的肺部生物发光值,提示JFK显著抑制肺部肿瘤的生长。JFK抑制肺部肿瘤组织中NLRP3的基因和蛋白表达,提高了mi R-155的表达。HE染色显示肺部肿瘤细胞较正常肺部细胞形态异形增大,细胞核显著增大,细胞排列紧密。给药组肺部肿瘤面积较模型组小,且高剂量给药组在各视野下均没有找到肿瘤组织。免疫组化的结果显示JFK抑制肺部肿瘤组织中的Ki67及NLRP3的阳性细胞的数量。3.JFK抑制细胞A549的体外增殖、平板克隆的形成并诱导其凋亡,部分通过失活AKT信号通路,抑制β-catenin和Cyclin D1蛋白表达,同时提高cleaved-PARP和actived-caspase3相关凋亡蛋白的表达。4.JFK抑制NLRP3及其组成和下游炎性因子的蛋白表达,降低细胞上清液中IL-1β的含量,抑制了NF-κB p65的蛋白表达,下调STAT3信号通路STAT3在T705和S727位点的磷酸化水平,且提高A549细胞中mi R-155的表达。5.通过高分辨质谱结合高效液相色谱的分析鉴定,JFK含黄芪甲苷、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷,其中淫羊藿苷含量为3.0 mg/10 m L,符合新药转正标准(1.0 mg/10m L)。6.淫羊藿苷显著抑制A549细胞的体外增殖,抑制细胞中NLRP3、β-catenin的蛋白表达,同时提高p21的蛋白表达。结论:1.敲低NLRP3或使用NF-κB抑制剂均能抑制细胞中NLRP3的表达,同时抑制A549细胞的体外增殖。提示NLRP3促进A549的恶性增殖。2.JFK抑制A549细胞肺癌原位荷瘤裸鼠模型中肿瘤的生长。免疫组化结果显示JFK处理组中NLRP3和Ki67阳性细胞数量减少。JFK抑制A549细胞的体外增殖、克隆的形成及诱导凋亡,部分通过失活PI3K/Akt信号通路。3.JFK通过提高mi R-155表达,抑制NF-κB的蛋白表达,下调STAT3的磷酸化水平,抑制NLRP3及其下游炎性因子的表达而抑制A549细胞的增殖和生长。提示JFK部分通过mi R-155-NF-κB/STAT3信号通路下调NLRP3而抑制A549的增殖和生长。4.淫羊藿苷抑制A549细胞的体外增殖,伴随着NLRP3和β-catenin蛋白表达的降低和p21蛋白表达的提高,其可能是金复康口服液抑制非小细胞肺癌增殖的物质基础之一。