应力性骨折诊断标志物的蛋白质组学研究

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背景:应力性骨折(stress fracture)是训练中最常见的一种过劳性损伤,尤其在新兵基础训练期间发生率高。陆、海、空三军新兵的应力性骨折的流行病学调查显示其发生率为12.45%,占军事过劳性损伤的71.5%。应力性骨折患者早期症状不明显,只有局部的疼痛,随着训练强度和训练负荷的加大,患病部位出现压痛和红肿。光镜下的病例学变化呈渐进加重性改变。目前用于应力性骨折诊断的手段主要有临床诊断、X线拍片、单光子计算机断层扫描(SPECT)和核磁显像(MR)。由于基层部队仪器设备的条件所限,目前应力性骨折的诊断主要依赖临床诊断。诊断应力性骨折以SPECT同位素骨扫描作为金标准,能在骨遭受应力损伤而患者无自觉症状时显示骨局部异常活跃的骨代谢活动。但由于其设备昂贵,专业性较强,不适于于普及诊断。应力性骨折的发病机理尚不清楚,应力性骨折的临床诊断多借助于病人的主诉以及影像学资料,往往发现较晚,贻误了病情。迄今,还没有一种有效的诊断方法来预防以及早期诊断应力性骨折。从差异蛋白质组学的角度寻找疾病生物标记物,是近年来蛋白质组学研究的热门话题,而象应力性骨折这样的部队常见病多发病,目前国内外仅仅只满足于流行病学的研究。对该疾病的早期诊断和防止还没有一套有效的方法。  目的:从整体的角度采用双向凝胶电泳和质谱分析等比较蛋白质组学技术,寻找、鉴定应力性骨折早期诊断肿瘤等疾病生物标志物,以提高应力性骨折治疗的早期诊断和防治水平。  方法:在去除高丰度蛋白的情况下建立了应力性骨折的血清双向电泳技术平台,采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF MS)对应力性骨折病例组与正常组进行了比较蛋白质组学的研究,并对其研究结果进行图像分析、蛋白酶解、质谱鉴定、数据库搜索和分析。对所发现的差异蛋白在应力性骨折发病机制中的作用进行分析。且进一步采用ELISA技术验证血清对氧磷酶-1单个血清标本中的表达意义,用SPSS软件对ELISA检测结果进行统计并描绘试验者对血清氧磷酶-1的工作特点曲线,计算其在诊断应力性骨折中的特异度、敏感度。  结果:利用双向电泳(2-DE)结合质谱技术分析正常组和病例组的血清样本来寻找可能的诊断标志物,实验结果表明paraoxonase-1、CRA_h、Serum albumin precursor、ALB、Transthyretin Chain A在病例组的表达明显高于正常组(P<0.05,n=10),而病例组Hemopexin precursor的表达则明显低于正常组;随后通过ELISA方法对每组血清标本内血清paraoxonas-1的含量进行了进一步验证,结果表明病例组和正常组血清标本内的paraoxonase-1含量展现了较为明显的差异,结果同双向电泳结合质谱技术分析结果一致,绘制血清paraoxonase-1含量下的ROC曲线,得到该方法的特异度77.8%,敏感度85.2%。  结论:本研究初步发现了病例组血清对氧磷酶-1、免役复合物CRA_h、白蛋白前体、白蛋白、甲状腺素运载蛋白中表达量增高,而正常组血红素结合蛋白(一种结合血红素的血浆糖蛋白)的表达量增高的差异表达。ELISA技术验证血样本结果显示其与采用混合血清样本的双向电泳技术所得的结果基本一致。初步得出了对氧磷酶-1作为应力性骨折早期诊断标志物的诊断价值,为早期诊断和预防应力性骨折打下了坚实的基础。
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