条件反射行为的研究历史长达一百年之久,其中眨眼条件反射行为是最简单,也是应用最广泛的联合学习记忆模型之一。经典的眨眼条件反射(Eyeblink conditioning, EBC)通常分为delay及trace两种模式,一般而言,以外周刺激(如视觉或听觉刺激)作为条件刺激(Conditioned Stimulus, CS)来建立眨眼条件反射模型；同时,我们也发现一些以电刺激外周视听信号上传路径所途经(中继)的局部脑区(或核团)作为条件刺激均成功建立了EBC的报告。已有研究提示前额叶在某些情况下参与了眨眼条件反射delay模式的建立或表达。这对传统的结论----前额叶不参与delay模式提出了挑战,对此我们也非常感兴趣,为什么在某些特殊情况下delay模式需要前额叶参与?因此,我们选择了前额叶中分布最多的谷氨酸能神经元作为研究靶点来探索谷氨酸能神经元参与眨眼条件反射(delay模式)的神经机制。光遗传学技术是通过基因工程的方法将目标光通道敏感基因包装到相关病毒上,并将其转染到动物的某一类神经元上,在完成一系列的分子生物学过程后光敏蛋白最终表达在特定细胞的细胞膜上,同时依据不同的光敏蛋白(如ChR2)的不同特性,实现对某一类型细胞或神经元精确至毫秒级的高分辨率调控的一门革命性技术。由于光遗传学的独特优势,光遗传学为我们验证delay-EBC在某些情况下可能需要前额叶谷氨酸能神经元参与的推测提供了目前为止最优的方法。通过Pubmed的检索,至今尚未发现以光刺激大脑内某一类神经元作为CS并成功建立EBC的报告。由此,我们采用光遗传学技术特异操控内侧前额叶(medial prefrontal cortex, mPFC)的谷氨酸能神经元,’并以光激活这一群谷氨酸能神经元作为CS,从而探讨此方式是否能成功建立delay-EBC及可能的内在神经机制。材料和方法：通过立体定向注射手段,把携带有细胞特异性启动子的视蛋白腺相关病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry注射到mPFC。病毒注射3～4周后,一方面通过荧光显微镜及激光共聚焦显微镜来判断神经元膜表面是否表达有红色荧光蛋白,以及其表达位置是否在mPFC,从而判断光敏基因在谷氨酸能神经元表达的特异性。并利用在体细胞外记录技术观察表达AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry的谷氨酸能神经元对不同光刺激频率的反应特性,用以了解ChR2的通道生理功能,为行为学研究奠定基础。另一方面经操控已经表达在自由活动动物mPFC谷氨酸能神经元上的ChR2通道完成行为学实验：待病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry靶向注射到大鼠右侧nPFC 4周后通过手术建立光神经界面,并预留打药孔,分别用蓝光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波宽,20 Hz)激活mPFC谷氨酸能神经元作为CS,电刺激眼轮匝肌作为US,观察是否能建立delay-EBC;待条件行为建立完成后以微注射技术向mPFC光照射部位注射短时失活药物muscimol (GABA-A受体激动剂,氯离子通道开放导致氯离子大量进入细胞而达到失活细胞的目的),观察对delay-DEC的影响。结果：(1)病毒成功注射到mPFC,94.6 ±0.9%的CaMKIIa表达的谷氨酸能神经元表达ChR2-mCherry蛋白,并且表达ChR2-mCherry蛋白的细胞98.87士0.3%是谷氨酸能神经元,提示在CamKⅡ a启动子控制下,腺相关病毒载体可将光敏基因特异性的表达于谷氨酸能神经元(2)表达有ChR2-mCherry蛋白的谷氨酸能神经元对蓝光(470 nm, 20 mW/mm2,5 ms波宽,5-80 Hz)产生稳定的反应,对低频光刺激(5、10和20Hz)的反应性优于高频光刺激(40和80Hz)。(3)以蓝光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波宽,20 Hz)激活mpfc谷氨酸能神经元为CS的条件下,大鼠能成功建立眨眼条件反射行为,通过靶向微注射muscimol能明显影响delay-EBC的条件反应(conditioned response, CR)的表达。结论：通过一系列的努力探索终于成功构建了眨眼条件反射的光遗传学平台,我们发现特异性激活mPFC的一群谷氨酸能神经元作为CS能成功建立delay-EBC,证明了我们之前推测的合理性。因此,本实验成功完成的意义不仅仅局限在技术平台的建立,而是特别有利于推动自由活动动物在体条件下对联合性学习记忆的神经细胞机制的进一步研究。