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本文采用ISSR分子标记对榕树地石榴(Ficus tikoua Bur.)的遗传多样性进行了测定与分析,揭示了地石榴居群的遗传多样性水平、居群间的遗传分化以及基因流的大小,并结合研究结果探讨了现生居群分布格局形成的原因,推测了其迁移路线以及可能的避难所。主要研究结果如下:
1.本研究建立了地石榴ISSR-PCR反应的最适宜体系和最佳反应程序。20μl体系中,10×buffer2.0μl,引物0.50μmol·L-1,dNTPs0.15mmol·L-1,Mg2+1.2mmol·L-1,Taq DNA酶1.25U,模板DNA25ng,无菌超纯水补充至20μl。最适宜的退火温度为52℃。
2.利用12条ISSR引物对14个天然居群的218个个体进行了扩增,共得到109条条带,其中77条为多态性条带。在物种水平上,地石榴的多态位点百分率(PPB)为70.64％,Neis基因多样性(Hsp)为0.1787,Shannon信息多样性指数(Isp)为0.2832;在居群水平上,各项指标的平均值:多态位点百分率(PPB)为15.07%,期望杂合度(Hpop)为0.0375,Shannon信息多样性指数(Ipop)为0.0601。结果分析表明地石榴遗传多样性处于相对较低的水平。利用POPGENE软件分析得出的Shannons居群分化系数(Isp-Ipop)/却为0.7878和Neis基因分化系数Gst为0.7830,表示约78%的变异发生在居群间,22%的变异存在于居群内;AMOVA居群遗传变异分析出血Φst值为0.720,揭示了地石榴居群间产生了极显著的遗传分化(P<0.001),在总的遗传变异中有72%的变异发生在居群间,28%的变异存在于居群内。三种指数都表示变异主要发生在居群间。
3.遗传距离和遗传一致度的结果表明:与其他居群相比,云南的水塘(ST)和恐龙谷(KL)的遗传距离最近,遗传一致度也最高;贵州兴义坡(XYP)和西藏下察隅(XCY)的遗传距离最远,遗传一致度也最低。在聚类图上,ST和KL优先聚为一支,表示亲缘关系较近;XYP和XCY聚在最远的分支上,表示亲缘关系较远。研究得出的Nm(0.1386)较小,花粉和种子难以远距离的散布和传播是造成居群间基因流较小的重要原因。
4.通过地石榴居群的NJ和UPGMA聚类图可以将14个居群分成3大支系:藏东南支系、横断山区-四川支系、云贵高原支系。其中,藏东南支系可能先分化出来,而藏东南支系与横断山区-四川支系和云贵高原支系之间的分化距离逐次增大。Mantel检验表明居群遗传距离与地理距离呈极显著的正相关性;而对海拔和期望杂合度(Hpop)做相关性分析,表明居群遗传多样性和和海拔不具有显著相关关系。综合聚类树和各支系的地理分布信息,推测地石榴的扩散路线可能始于藏东南地区,经横断山区-四川扩散到云贵高原地区。另外,遗传距离和聚类分析都表明,西藏下察隅(XCY)居群和其他居群的亲缘关系最远,结合形态学数据分析,认为其在长期的隔离进化过程中,与其他居群已经产生了很大分化,可能已经向亚种或者新种方向演化了。
5.叶绿体DNA通用引物TrnL-TrnF对地石榴部分个体扩增的结果显示个体间没有变异,表明地石榴叶绿体DNA序列在该位置没有变异,因此该片段不适合做地石榴物种内的遗传分析。进一步考察地石榴扩散过程以及发生的时间,需筛选出变异性高,多态性好的序列片段以及运用分子亲缘地理学知识来进行。