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青枯病是青枯劳尔氏菌引起的一种细菌性土传病害,难以防治,传统农药虽具有一定的防治效果,但环境污染、耐药性增加等问题逐渐暴露。本课题组前期研究发现,咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phenethyl ester,CAPE）等咖啡酸酯类化合物作为一种绿色的天然抗菌化合物,对青枯菌具有良好的抗菌活性。因此,本研究以壳聚糖为功能化载体,咖啡酸苯乙酯为药效分子,偶联青枯菌单克隆抗体,制备靶向桑青枯菌的纳米药剂,以期实现桑园青枯病防治的减量增效。主要研究内容如下:（1）靶向桑青枯菌的壳聚糖新型纳米颗粒制备。采用离子凝胶法,以壳聚糖为功能化载体,制备负载咖啡酸苯乙酯的壳聚糖纳米颗粒（Chitosan nanoparticles,CS-NPs）。以包封率和载药率为指标对制备工艺进行优化,检测CS-NPs的包封率及载药率,并使用Fickian模型分析缓释动力学。结果表明,当CAPE与咖啡酸甲酯（Methyl caffeoate,MC）比例为8:0时,CS-NPs的包封率和载药率分别为94.10%和97.30%,远高于已报道抗青枯菌纳米药剂的平均载药率（50-60%）。颗粒在p H为6.5、7.4和9.5的磷酸盐缓冲液中未见明显的突释期,理论半衰期达7.3-11.5 d,比课题组前期制备的纳米颗粒延长1.5-2.4 d。在此基础上,使用EDC/NHS化学偶联法,将桑青枯菌单克隆抗体修饰至壳聚糖纳米颗粒表面,制备壳聚糖靶向纳米颗粒（Targeted nanoparticles,CS-TNPs）。通过免疫PCR和SEM验证桑青枯菌可被抗体特异性捕获,CS-TNPs处理后的桑青枯菌表面可观察到药剂颗粒的结合与吸附现象。因此,本研究成功制备出对桑青枯菌具有特异性结合能力的壳聚糖靶向纳米药剂,与病原菌靶向结合,并实现了药效分子的精准控释。（2）负载CAPE的壳聚糖靶向纳米药剂的抗菌性能。使用酶标仪测定CS-TNPs的半抑制浓度及最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentrations,MIC）,结果表明在CAPE浓度为4 mg/m L时,CS-TNPs的抑菌率为93.02%,EC50值为0.98 mg/m L,与原药相比,用药量减少了1.94倍。另外,CS-TNPs的分数抑制浓度指数为0.375,首次提出壳聚糖与CAPE对桑青枯菌具有抑制的协同作用。在相同剂量下,CS-TNPs显著抑制桑青枯菌形成生物膜,比壳聚糖和CAPE单独使用的效果分别提高5.3和4倍,同时平板抑菌直径（13 mm）比药物分子增加1.5mm,验证对桑青枯菌具有更强的抑制作用。SEM结果显示,使用CS-TNPs处理后的桑青枯菌形变与破损更加严重,细胞膜表面出现明显的破孔与凹陷。CS-TNPs的FTIR结果表明,CAPE在3199 cm-1、2883cm-1和1602 cm-1处主峰降低,已被壳聚糖成功负载。Zeta电位、TEM与粒径分析结果显示,CS-TNPs平均粒径为175.13 nm,呈现多孔结构,且偶联抗体后的纳米颗粒Zeta电位由49.5m V降至2.71m V,证明抗体成功偶联。因此,本研究验证了CS-TNPs可通过与桑青枯菌特异性结合破坏细胞膜的表面结构,从而导致桑青枯菌细胞内容物的溢出,具有一定的抑制作用,与药效分子相比表现出更强的抗菌活性。（3）壳聚糖靶向纳米颗粒对桑青枯菌活性氧生成的影响及抑菌机制分析。通过DCFH-DA染色法和q PCR检测不同药物处理后的桑青枯菌的活性氧生成情况,以及致病性相关基因表达量的变化。结果表明,CS-TNPs可以通过提高细菌活性氧的生成水平,对细菌生物膜造成损伤,并显著下调桑青枯菌相关致病基因egl、phc A、hrp B、pil T、pol A、peh C的表达,表达量分别下降至原料药组的1.33、2.11、1.30、1.53、1.61和1.32倍;桑青枯菌III分泌系统相关效应子RS5-1997、RS5-2036、RS5-4055、RS5-4374、RS5-4819表达量与原料药相比,分别下降1.22、1.43、1.43、1.28和1.59倍,均出现显著下调。因此,CS-TNPs可以通过增强菌体的氧化应激,抑制桑青枯菌侵染前期的运动和环境适应能力以削弱其致病力;同时CS-TNPs可以显著下调III型效应子表达,影响宿主植物的免疫反应和定殖后的增殖与扩散,在基因水平上对CS-TNPs的抑菌过程有了新的认识。综上所述,本研究利用价格低廉的壳聚糖代替PLGA作为药物载体,成功开发出对桑青枯菌具有靶向作用的壳聚糖纳米颗粒,大幅降低药物制剂成本,并提高抗菌活性,在青枯病的防治中具有潜在的应用价值。