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膜蛋白因受其自身性质所限,大量表达会对细胞产生毒害作用,且在真核表达系统中低表达。本研究利用多角体(Polh)基因与目的基因融合表达以降低其毒性作用并提高表达量。从本实验室所构建的家蚕膜蛋白cDNA库中筛选获得一条基因大小为1127 bp,其中开放阅读框为840 bp的序列,编码一个含279个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为30.3 kDa,等电点为8.79。生物信息学分析发现它与结核分枝杆菌所表达的echA蛋白具有较高的同源性,都含有一个crotonase-like的保守结构域,所以命名这个基因为BmP(echA)-like(Bombyx moriProtein of Enoyl-CoA hydratase like),GenBank登录号为:DQ311163.1。
本研究通过亚克隆技术获得了多角体与BmP(echA)-like的融合基因,分别克隆到原核表达载体和杆状病毒转移载体上构建了pET-32a-Polh-BmP(echA)-like和pFastBac HTb-Polh-BmP(echA)-Hke,同时构建了未融合多角体的BmP(echA)-lik基因的重组载体pET-32a-BmP(echA)-like和pFastBac HTb-BmP(echA)-like作为表达对照。用终浓度1mmol/L IPTG诱导含pET-32a-Polh-BmP(echA)-like的BL21(DE3)工程菌后,裂解产物进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结果与阴性对照以及未融合多角体表达的产物进行对比分析,发现特异的目的融合蛋白条带大小正确。利用pFastBac重组转移载体及家蚕Bac-to-Bac系统构建了重组Bacmid,转染家蚕细胞后表达产物经SDS-PAGE电泳检测表明,在两个不同的表达系统中,融合了多角体的目的蛋白表达量都有明显提高。融合蛋白利用多角体在不同pH值条件下的溶解度差异可简单、快速纯化重组蛋白,通过FPLC反相柱与Ni-NTA柱亲和层析可获得高纯度的目的蛋白。纯化的融合蛋白经TEV酶切后,通过调节pH值便能得到单一的BmP(echA)-like蛋白条带。为了解该蛋白在家蚕各组织中的分布,我们做了荧光定量PCR的相关实验,结果显示五龄幼虫的各组织器官均有转录,其中气门转录最高,而表皮组织中最少,转录差异可达近60倍。通过双向电泳分析,发现在家蚕细胞中至少有分别为35 kDa和60 kDa的蛋白与BmP(echA)-like发生相互作用。