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热休克蛋白作为分子伴侣,是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类高度保守的蛋白质,参与蛋白质的折叠,组装以及跨膜转运,并且能够防止蛋白质的变性、凝聚以及促进变性蛋白的分解代谢。热休克蛋白110(Heat shock proteins 110,Hsp110)作为Hsp70(Heat shock proteins 70,Hsp70)的同源蛋白,是一类在真核生物中丰富表达的蛋白质,能在哺乳动物组织尤其是哺乳动物大脑中高度表达。作为Hsp70蛋白功能所必需的核苷酸交换因子(Nucleotide Exchange Factor,NEFs),Hsp110在防止变性蛋白凝聚方面显示出了较Hsp70更高的活性,然而其并不具备类似Hsp70的促进蛋白质折叠的活性,因此Hsp70被称为折叠酶(foldase),而Hsp110被称为持家酶(holdase)。Hsp110在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中有 Sse1(Yeast Stress Seventy Protein1)和 Sse2(Yeast Stress Seventy Protein2)两种主要形式,其中 Sse1是酵母在正常生长条件下表达的主导蛋白,而在诸如热激等条件下,Sse1被进一步诱导表达的同时,Sse2也会被诱导表达。同时Sse1也具备加快Hsp70核苷酸交换速度的作用。Sse1最先作为钙调蛋白结合蛋白从酿酒酵母中分离出来,其晶体结构已得到解析,因此Sse1常被用作研究Hsp110的模型。为了研究Sse1底物结合结构域的主要功能位点,本实验室依据Sse1与Hsp70的结构同源性,首先在野生型Sse1的主要功能区域(底物结合结构域,Substrate Binding Domain,SBD)进行了 8 个位点的突变:Sse1-loop12,Sse1-loop23,Sse1-loop34,Sse1-loop45,Sse1-loop56,Sse1-loop67,Sse1-loop78,Sse1-G466PG472P,通过 DNA 测序鉴定正确后,对其进行表达纯化。然后通过荧光偏振技术对突变型Sse1和野生型Sse1的底物结合能力进行了比较。进而通过酵母体内生长实验,从酵母生长表型上探究不同Sse1突变体对酵母表型的影响。最后通过蛋白质免疫印迹技术检测酵母中Sse1的表达情况,以探究这些突变对酵母表型的影响是否源自蛋白功能的丧失。实验表明,相较于野生型Sse1,Sse1-loop12和Sse1-loop78的底物亲和性无明显变化,且其表型也与野生型相一致,只有Sse1-loop45虽然显示出了更高的底物亲和性,却在表型上与野生型Sse1无差异,有待进一步探究。而其他Sse1突变的底物结合亲和力均提高了 2-3倍,且在表型上与野生型显示出一定的差异。蛋白质免疫印迹结果显示,Sse1及其不同突变在酵母体内均正常表达,说明不同突变在表型上的差异并非由蛋白质不能表达引起,而可能是突变后蛋白质失去了原有功能,也可能是突变蛋白不稳定,易降解导致功能失常。本实验为研究Sse1底物结合结构域位点的生物化学功能提供了初步的实验数据。