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目的：LRP16基因（Leukemia related protein16LRP16）是我们课题组于1999年首先克隆的，定位于染色体11q12.23的基因，其表达产物是一个核蛋白。研究发现LRP16基因特异性的受雌激素受体a (ERa)的调控，ERа通过与LRP16启动子的1/2ERE/Sp1序列结合上调LRP16mRNA的表达。LRP16基因作为ERа调控的靶基因，反馈增强ERа介导的转录激活活性，是ERа的一个共激活因子。近年来相继报道的大型绝经期妇女小剂量雌激素替代治疗研究，发现雌激素替代治疗可以有效降低体重，改善绝经后妇女体脂重新分布的程度。基础研究发现脂肪细胞上表达ERа和ERβ，雌激素主要通过ERa调控脂肪细胞中瘦素的表达。因此，我们提出LRP16作为ERa的靶基因及ERa的共激活因子，可能具有调控脂肪细胞中瘦素表达的功能。本研究通过3T3-L1脂肪细胞建立过表达LRP16基因的稳定细胞系，探讨LRP16基因对脂肪细胞中瘦素表达的影响及其可能的机制。方法：1)建立LRP16基因过表达的3T3-L1稳定细胞系将3T3-L1细胞按80%密度接种于6cm培养皿中，24h后按superfect transfection说明书将pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1转染细胞，24h后更换为含800μg/mlG418的DMEM培养基进行抗性筛选3周，以后用含半量400μg/ml G418的DMEM培养基培养细胞，构建LRP16过表达细胞系3T3-L1-16及对照细胞系3T3-L1-3.1。用Western Blot的方法进行验证。2) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素表达的影响a) Western blot检测在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中（诱导第0、4、8天）瘦素及LRP16蛋白的表达量变化。b) Western blot检测在10-5、10-7及10-9mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用下3T3-L1脂肪细胞中ERа蛋白表达量。c) Q-PCR检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5、10-7及10-9mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用下leptin mRNA水平。d) ELSIA检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5、10-7、10-9mol/L的ERа激动剂PPT或ERа抑制剂MPP作用24h或48h后细胞上清液中leptin表达量。e) Western blot检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用24h后leptin表达量。3) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素JAK/STAT信号通路的影响a) LRP16基因对JAK/STAT信号通路的影响: Q-PCR检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量的差异。Western Blot法检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中JAK2-STAT3信号通路关键蛋白pJAK2(tyr1007/1008)、pSTAT3(tyr705)表达量的差异。b)10-5mol/L ERа抑制剂MPP干预24h后，Western blot检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中pJAK2(tyr1007/1008)、pSTAT3(tyr705)表达的变化。4) LRP16对瘦素转录活性的影响a)构建leptin启动子核心区质粒，与pGL3-basic连接为pGL3-lep-(-762)。b)将pGL3-lep-(762)、ERа真核表达载体、pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-16、pRL-TK共转染ERа阳性MCF-7细胞及ERа阴性COS-7细胞及Hela细胞。双荧光素酶报告检测系统检测p (-762)lep-luc相对荧光素酶活性以反映leptin启动子转录活性。ERа抑制剂MPP预干预MCF-7后，共转染上述质粒后，检测MPP对LRP16所调控的瘦素启动子活性的影响结果：1)建立LRP16基因过表达的3T3-L1稳定脂肪细胞系SuperFect脂质体转染法分别把质粒pcDNA-3.1-16和空白质粒pcDNA-3.1转入3T3-L1前脂肪细胞中，经G418筛选，获得稳定过表达LRP16的细胞株。通过Western blot检测，过表达LRP16的细胞系（3T3-L1-16）的LRP16表达量约为对照组细胞系（3T3-L1-3.1）的2.37倍(p<0.05)。2) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素表达的影响a) Western blot检测3T3-L1脂肪细胞在诱导分化中LRP16及leptin表达的变化：脂肪细胞诱导分化中leptin表达量逐渐增加，第4、第8天leptin蛋白表达量较诱导初具有统计学差异；LRP16表达量也随诱导分化时间延长而增加，第4天、第8天LRP16表达量较诱导初具有统计学差异。b) Western blot检测PPT（10-5mol/L）作用3T3-L1脂肪细胞ERa表达量较对照组增加(P<0.01)；相反，MPP作用下3T3-L1脂肪细胞ERa表达量较对照组(p<0.01)及低浓度组明显下调。c) Q-PCR示，3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5mol/L的ERа激动剂PPT作用下较空白组leptin mRNA表达无明显增加，10-5、10-7、10-9mol/L ERа抑制剂MPP作用下leptin mRNA表达均较空白组下调，其中10-5、10-7mol/L的MPP下leptin mRNA表达下降具有统计学差异。d) ELSIA示，10-5、10-7、10-9mol/L ERа激动剂PPT作用24h及48h，两组细胞上清液中leptin蛋白表达均较无PPT作用组上调，其中10-5mol/L的PPT下leptin蛋白表达上调具有统计学差异。PPT作用24h与48h组间无统计学差异。10-5、10-7、10-9mol/L ERа抑制剂MPP作用24h及48h，两组细胞上清液中leptin蛋白表达均较无MPP作用组下调，其中10-5、10-7mol/L的MPP下leptin蛋白表达下降具有统计学差异。MPP作用24h与48h组间无统计学差异。e) Western blot示，10-5mol/L的PPT及MPP作用24h leptin蛋白表达均较空白对照组增加（或下降），具有统计学差异。3) LRP16对3T3-L1脂肪细胞JAK/STAT信号通路的影响a) Q-PCR结果示过表达LRP16基因的3T3-L1-16组JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量分别为对照组3T3-L1-3.1的1.46倍（P<0.01）、1.25倍（P<0.01）及1.49倍（P<0.01）。Western blot示过表达LRP16基因的3T3-L1-16组pJAK2(tyr1007/1008)、pS TAT3表达量分别为对照组3T3-L1-3.1的1.97倍（P<0.01）和1.18倍（P<0.01）。b)10-5mol/L的ERа抑制剂MPP作用下，3T3-L1-16组JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量是空白3T3-L1-16组JAK2mRNA的31.4%（P<0.01）、57.1%（P<0.01）及91.5%。Western blot提示MPP干预后3T3-L1-16组pJAK2(tyr1007/1008)、pS TAT3表达量分别为未干预3T3-L1-16组的48.2%（P<0.01）和53.4%（P<0.05）。4) LRP16对瘦素启动子的影响a)构建瘦素启动子（-762bp到+29bp）的荧光素酶报告载体pGL3-lep（-762）。对所需合成的基因全序列进行分析，进行单链oligo的设计及合成；利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因，测序验证得到正确基因片段；目的基因和质粒载体pGL3-Basic进行NheI和HindIII双酶切，T4DNALigase连接构建亚克隆载体pGL3-Basic-Lep(-762)转化至感受态细胞；对转化的亚克隆载体进行测序，得到正确结果。b)在ERа阳性的MCF-7细胞中LRP16呈剂量依赖性的上调p(-762)lep-luc的转录活性，当pcDNA-3.1-16量为0.5μg时，p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性上调至为对照组的2.63倍（P<0.05）。而在ERа阴性的COS-7及Hela细胞中，LRP16未明显上调p(-762)lep-luc的转录活性；共转染ERа后，在COS-7及Hela细胞，LRP16明显上调p(-762)lep-luc的转录活性。当pcDNA-3.1-16量为0.5μg时，p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性升高为对照组的2.6倍（P<0.01）及2.7倍（P<0.01）。pcDNA-3.1-16质粒量为0.5μg时，MPP干预组p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性为非干预组的41.3%（P<0.01）。结论：1)成功构建了过表达LRP16细胞系及对照细胞系，为后续实验研究提供了稳定的细胞模型。2) LRP16基因上调3T3-L1脂肪细胞瘦素表达，ERa抑制剂部分抑制LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素的上调。3) LRP16基因通过影响JAK/STAT信号通路，从而影响3T3-L1脂肪细胞瘦素主要生理功能。4) LRP16基因对瘦素具有转录激活作用，部分依赖ERa的调控。总之，LRP16基因对从转录水平上调脂肪细胞瘦素表达，影响瘦素下游JAK/STST通路。而且LRP16对瘦素的调控部分依赖于ERa的存在。