一.研究背景支气管哮喘(Bronchial asthma)是常见的气道慢性过敏性炎症性疾病,糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是目前治疗支气管哮喘气道慢性炎症的主要药物,尤其是引入吸入GCs。吸入GCs由于其发挥作用快,副作用小,受到人们的重视,发展迅速,临床上应用最广泛,而口服或静脉使用GC由于全身副作用较大,现在仅用于缓解重度支气管哮喘急性大发作。与其他药物一样,临床上支气管哮喘患者对激素治疗表现出很大个体差异。绝大部分患者经口服或吸入GCs后病情得到控制甚至临床痊愈,但是一小部分支气管哮喘患者应用GCs治疗无效,使用更大剂量或长期应用GCs治疗,其症状和肺功能也不会得到明显改善,而只能导致严重的副作用,这种对激素治疗不敏感的哮喘称为激素抵抗型哮喘(Steroid-resistant asthma, SRA)。SRA是Schmart Z等在1968年报道了6例哮喘患者在大剂量GCs治疗后症状无明显改善而首次提出来的。目前关于SRA的诊断比较公认的标准是：哮喘患者如果使用足量的激素(口服泼尼松龙每天≥40mg)和足够的疗程(≥2周),而其FEV1%未能在≤75%预计值的基础上增加15%,不管在吸入p受体激动剂后FEV1%改善是否>15%,即符合SRA的定义。国外报道,SRA约占支气管哮喘患者的10%,国内SRA患者所占比例目前缺乏相应的数据。虽然SRA患者与一般哮喘患者相比并不算多,但在实际医疗工作中,SRA患者的诊治却耗费了主要的医护力量及医疗资源。随着GCs在支气管哮喘患者的广泛应用,治疗这一部分患者的重要性越来越受到临床医生的重视,迫切需要了解SRA的发病情况,并努力寻找SRA的预测因子,把握临床治疗决策,减少治疗错误给患者带来的经济负担和严重的副作用。丝切蛋白-1(cofilin-1)具有肌动蛋白解聚因子的特征,它与肌动蛋白解聚因子(actin depolymerization factor, ADF)和Cofilin-2共同构成在进化上高度保守的ADF/cofilin家族,大量表达于胚胎期和成熟组织中。ADF/cofilin家族是许多细胞进程如细胞运动,细胞分裂和细胞膜形成所必须的。丝切蛋白与肌动蛋白丝的结合改变了肌丝的扭曲,从而促进肌丝的分离和解聚。除了以上作用外,最近研究证实,在激素抵抗HeLa细胞中,cofilin-1可以影响糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的亚细胞分布,增加GR在细胞核中的分布,抑制GR的活性,它的过表达,不仅引起细胞骨架的破裂,而且通过上调c-JUN减弱糖皮质激素的功能,在GC抵抗中发挥重要作用。Nisha Vasavda和同事进一步研究了cofilin-1在支气管哮喘GC抵抗中的作用,他们初步证实GC不敏感患者外周血CD4+T细胞中cofilin-1的表达明显高于GC敏感患者,同时在体外培养的JurkatT细胞中,cofilin-1的表达不受地塞米松的影响,其过表达可以减弱GC对细胞因子的抑制。另外cofilin-1可以促进T淋巴细胞趋化,而哮喘的发生进展过程与TH2细胞的过度活化是密切相关的。过度活化的TH2细胞释放炎症因子IL-33,其与TH2细胞表面的特异性受体ST2L结合后又促进以TH2细胞为主的炎症过程。Prefontaine,D在研究哮喘病人中发现哮喘病人的气道平滑肌活检组织中IL-33的表达量不论是基因水平还是蛋白水平都要高于正常对照组,这种趋势在重症哮喘中尤其明显,IL-33可能是重症哮喘和难治性哮喘的一种新型炎症标志因子。而至今尚未有学者研究支气管哮喘患者糖皮质激素治疗前后cofilin-1的表达水平的变化。如果与他们所做的体外实验一样,地塞米松对cofilin-1的表达无影响,那么cofilin-1的过表达是否是疾病本身引起GC抵抗的一个原因,是否可以作为一个GC治疗反应性的预测因子值得进一步的探讨。为此本课题通过对三年中在门诊明确诊断的支气管哮喘患者给予最新哮喘防治指南推荐的正规的GC分级治疗,观察GC治疗的反应性,根据国际上SRA的诊断标准筛选SRA患者,了解本地区的SRA发病情况和GC治疗反应性与外周血cofilin-1表达的相关性,探索cofilin-1作为GC治疗反应性预测因子的可能。二.研究目的通过评估哮喘患者对激素治疗的反应性,了解本地区SRA发病情况,分析糖皮质激素治疗反应性与cofilin-1表达水平的相关性,探索cofilin-1作为激素治疗反应性预测因子的可能,并对SRA可能的发病机制进行部分研究(GRp和IL-33的过表达)。三.材料和方法收集2008年6月-2010年12月南方医院呼吸科门诊诊断支气管哮喘的患者,诊断标准和严重程度的分级严格按照中华医学会呼吸病学分会哮喘组制定的最新标准执行。所有诊断支气管哮喘的患者,收集其个人史、职业史、家族患病史等资料,并完成ACQ5评分和24小时症状评分,行肺功能检查,筛选出FEV1%≤75%的患者作为实验对象(共收集375例支气管哮喘患者病历,仅小部分患者筛选入组)。给予支气管哮喘患者中华医学会呼吸病学分会哮喘组2008年推荐的GC分级治疗,入组患者给予口服泼尼松40mg治疗,比较治疗前和治疗2周后肺功能改善情况。根据国外文献中提及的SRA诊断标准,从所有诊断明确并给予正规治疗的患者中筛选SRA患者。根据肺功能FEV1%情况,FEV1%≤75%的患者治疗2周后FEV1%是否升高15%将患者分为SSA(Steroid-sentive asthma)组(23例)和SRA组(8例),对其相关指标进行比较。采集治疗前患者外周血9m1,2m1用于检测外周血嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数,5m1用于分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),提取细胞总蛋白,通过(?)Western blotting技术检测PBMCs中cofilin-1蛋白的表达,并用Western blotting技术检(?)(?)JPBMCs中糖皮质激素受体beta(GRβ)的表达情况,另外2m1外周血分离血浆备用,ELISA法测定外周血血浆IL-33含量。并对治疗前患者行诱导痰细胞分类计数。治疗2周后,患者复诊再次收集外周静脉血5ml用于分离单个核细胞,检测cofilin-1和GRp表达情况。统计学处理,采用SPSS13.0进行统计分析,数据用均数±标准差(x±s)和中位数(Median)表示。符合正态分布两组比较采用t检验；不符合正态分布两组比较采用非参数检验(Mann-Whitney U Test),配对样本非参数检验用Wilcoxon符号秩和检验；样本率与总体率的比较采用二项分布检验(Binomial Test);基本资料的比较采用两独立样本t检验和χ2检验,以a=0.05作为检验水准。外周血cofilin-1水平与肺功能指标和细胞分类计数百分比作等级相关分析(Spersman相关)。四.结果1、共收集375例支气管哮喘病历,入组23例激素敏感型哮喘患者(SSA)和8例激素抵抗型哮喘患者(SRA)。SRA发病率约为2.1%(8/375),低于国外统计数据SRA的发病率10%(Binomial Test, P=0.000)。2、两组之间基本资料的比较：(1)两组年龄比较无显著差异(t=-0.055,P=0.957)。(2)两组性别分布无显著差异(P=0.698)。(3)两组病程之间的比较无显著差异(t=-0.297,P=0.769)。(4)两组ACQ5评分、白天症状评分、夜间症状评分的比较结果均无显著差异(分别为t=-1.038,P=0.308；t=0.293,P=0.772；t=-0.635,P=0.531)。3、口服激素治疗之前,两组患者的肺功能指标FEV1%之间比较无明显差异(62.7(40-70.3)vs44.8(41-51.2),Z=-1.851,P=0.064)。治疗之后,SSA组患者FEV1%明显改善(62.7(40-70.3)vs78.4(67.4-84.3),Z=4.198,P=0.000),但SRA组患者FEV1%却无明显变化(44.8(41-51.2)vs41.8(31.2-52.3,),Z=-0.210,P=0.833)。4、口服激素治疗之前,SRA患者诱导痰中性粒细胞百分数(S-NEU%)要高于SSA患者(48.5(45-62)vs35(33-41),Z=-3.216,P=0.001),而两组诱导痰嗜酸性粒细胞百分数(S-EOS%)比较无明显差异(6(2-11)vs7(3-16),Z=-0.906,P-0.365)。两组患者外周血中性粒细胞计数百分比(B-NEU%)(57.0(53.5-64.4)vs61.3(53.7-66.8),Z=-0.711,P=0.477)和嗜酸性粒细胞计数百分比(B-EOS%)(6.7(4.7-6.8)vs4.2(1.9-5.5),Z=-1.791,P=0.073)比较无明显差异。5、口服激素治疗之前,SRA组患者外周血PBMCs cofilin-1的表达水平显著高于SSA组(Cofilin-1/β-actin为1.82(1.29-2.24)vsl.21(1.00-1.29),Z=-2.884,P=0.004)。治疗后,SSA组cofilin-1明显下降(1.21(1.00-1.29)vs0.67(0.46-0.97),Z=-4.045,P=0.000),而SRA组cofilin-1无明显变化(1.82(1.29-2.24)vs1.51(1.24-1.96),Z=-1.680,P=0.093)。6、口服激素治疗之前患者外周血cofilin-1的表达水平与患者FEV1%改善程度呈明显的负相关(r=-0.397,P=0.027),与患者诱导痰中性粒细胞百分数呈正相关(r=0.439,P=0.022),而与患者诱导痰嗜酸性粒细胞百分数(r=-0.217,P=0.276)、外周血中性粒细胞百分数(r=0.074,P=0.697)和嗜酸性粒细胞百分数(r=0.251,P=0.182)均无明显相关。治疗前后cofilin-1的下降程度与患者PEF%的改善程度呈正相关(r=0.37,P=0.044)。7、用我们的检测方法,23例激素敏感型哮喘患者外周血PBMCs中几乎检测不到GRp的表达,8例激素抵抗型哮喘患者经过治疗后GRp的表达明显升高(GRp:p-actin ratio12.83*10-3vs216.4*10-3, Z=-2.521, P=0.012)。8、口服激素治疗之前,SRA患者外周血血浆IL-33(pg/m1)含量要稍高于SSA患者(87.00(71.57-110.54)vs72.76(61.23-82.76),Z=2.032,P=0.042)。五.结论1、广州地区激素抵抗型哮喘的发病率较低。2、诱导痰技术在气道炎症诊断中的发挥重要作用,SRA的炎症表型可能为中性粒细胞炎症为主。3、Cofilin-1的表达水平与哮喘患者对激素治疗的反应性有关,cofilin-1可能作为激素治疗反应的预测因子。4、SRA患者经过治疗后GRp的表达明显升高,治疗前SRA患者外周血血浆IL-33含量要稍高于SSA患者。我们推测二者可能通过不同途径参与到激素不敏感过程中来,这为提出新的治疗方案奠定基础。5、cofilin-1可能通过影响糖皮质激素受体的核转移引起GRB的过表达。cofilin-1可以促进中性粒细胞的趋化,造成气道中性粒细胞浸润。cofilin-1促进T淋巴细胞的趋化,可以通过IL-33与配体结合激活TH2细胞,释放相关炎症因子。以上这些都可能造成患者对激素治疗的反应性低下。