研究背景宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤,是严重威胁我国女性健康的疾病。在所有恶性肿瘤中,宫颈癌的发病因素最为明确,高危人乳头瘤病毒(HPV)感染是关键和必要的致病因素。宫颈癌明确的致病因素和缓慢的发病过程为宫颈癌的防治提供了宝贵时机。在所有HPV基因型中,目前已明确有15个型与宫颈癌相关,属于高危型,但仍有多个HPV基因型因感染率较低,其危险度的确定仍有待于进一步的研究。已知HPV基因型分布具有地区差异,但国内HPV基因型分布的数据较少,浙江省尚无报道。在HPV基因型的检测方法上,虽然方法种类多,但仍存在各种问题,如不能区分具体基因型(如杂交捕获法),灵敏度低(southern blot),覆盖的基因型较少(PCR-杂交法),价格昂贵(基因芯片法)等。因此,建立一种合适的HPV基因型检测方法,检测并确定来自浙江省的宫颈癌及其前期病变患者感染的主要HPV基因型具有非常重要的意义。宫颈癌的疫苗已取得了重大进展,但是由于疫苗是通过预防HPV感染进而预防宫颈癌的发生,而HPV高感染率高自然清除率的特点使价格昂贵的疫苗难以在中国妇女中进行普及。在中国更现实可行的方法是通过治疗高危HPV持续感染来预防宫颈癌的发生。新兴的RNA干扰(RNAi)技术为高危HPV持续感染癌基因的阻断治疗提供了新的手段。目前RNAi在宫颈癌上的研究基本集中在HPV E6/E7转录后水平的基因沉默。但由于病毒特有变异能力,探索多个途径基因沉默的研究非常重要。最新研究发现,RNAi也可在转录水平发挥作用,与启动子同源的siRNA可通过DNA甲基化及其他表观遗传学机制使下游基因表达沉默。HPV16癌基因E6和E7具有共同的启动子,为RNAi在转录水平同时沉默E6和E7转录提供了可行性,但迄今尚未见利用RNAi对HPV病毒基因在转录水平沉默的研究报道。由于RNAi转录水平的作用机制涉及DNA甲基化,因此也有必要了解不同宫颈HPV感染状态(HPV感染的宫颈癌及其前期病变、单纯感染)下HPV16关键调控区的DNA甲基化状态,探索其在宫颈癌发生过程中的意义,也有助于为干扰靶点的选择提供指导价值。因此,本研究拟建立一种覆盖HPV基因型广、性价比高的HPV基因型检测方法,对来自浙江省宫颈癌及其癌前病变患者的HPV基因型进行检测,确定浙江省宫颈癌及其癌前病变患者的主要HPV基因型;对最常见的基因型HPV16,通过宫颈癌及其前期病变和单纯感染中HPV16主要调控区DNA甲基化的检测,明确DNA甲基化状态在宫颈癌变过程中的意义;在此基础上,利用小干扰RNA靶向HPV16启动子区在转录水平诱导癌基因E6/E7的基因沉默,以探索HPV16癌基因沉默的新途径。第一部分一种HPV基因型检测方法的建立目的:建立一种生殖道HPV基因型的检测方法方法:针对各生殖道HPV基因型的序列,选择合适的限制性内切酶,设计PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法),以杂交捕获法(HCⅡ)检验该方法的敏感性,用测序法检验该方法的准确性。结果:建立了一种检测生殖道HPV基因型的PCR-RFLP法,建立各常见基因型的酶切图谱。PCR-RFLP和HCⅡ法HPV检测的符合率为92.4%。PCR-RFLP法判定的HPV基因型均与测序法检测的结果一致。结论:PCR-RFLP法检测生殖道HPV感染基因型准确性高、覆盖基因型广、性价比好,可用于HPV基因型的检测。第二部分宫颈癌及其前期病变的HPV感染及其基因型分布目的:了解来自浙江省的宫颈癌及其前期病变患者的HPV感染及其基因型的分布情况方法:以2004年5月至2006年4月间在浙江大学医学院附属妇产科医院以宫颈疾病就诊的患者为研究对象,用PCR-RFLP法检测HPV基因型的感染情况。共成功检测了631例宫颈癌及其前期病变患者,其中宫颈癌(181例)、CINⅡ-Ⅲ(345例)、CINⅠ(105例)。以217例年龄配对的无细胞学异常者作为对照。结果:宫颈癌中HPV的感染率为95.0%,CINⅡ-Ⅲ中感染率为88.4%,而CINⅠ中的感染率为73.3%。在宫颈癌及其前期病变中共检测到24型HPV。在宫颈癌中主要的基因型为HPV16,HPV18和HPV58;而在CIN中主要基因型为HPV16,HPV58,HPV33和HPV18。HR-HPV与LR-HPV的比例随着CIN级别的增加直至宫颈癌逐渐增加。HPV16的构成比亦随CIN级别的增加直至宫颈癌逐渐增加。结论:1.宫颈癌HPV的感染率为95.0%,CINⅡ-Ⅲ88.4%,CINⅠ73.3%提示浙江省宫颈癌及其前期病变的HPV感染率高于中国其他地区。2.宫颈癌主要的基因型为HPV16,HPV58,HPV18,CIN主要的基因型为HPV16,HPV58,HPV33和HPV18,提示除HPV16和18以外,浙江省宫颈癌及其前期病变的主要基因型为HPV58,可能也包括HPV33。第三部分宫颈癌及其前期病变和单纯感染中HPV 16长控制区的甲基化检测目的:获得HPV16 LCR关键区域的详细甲基化信息,探索HPV16 LCR区甲基化在不同宫颈HPV16感染状态中的意义。方法:采用亚硫酸氢修饰后焦磷酸测序法,检测了70例临床宫颈标本的HPV16的甲基化状态,包括26例宫颈癌,13例高度宫颈上皮内瘤变(CINⅢ),17例中低度宫颈上皮内瘤变(CINⅠ-Ⅱ)和14例单纯感染者。结果:HPV16 LCR总体甲基化状态显示宫颈癌和HPV16单纯感染中HPV16LCR区的甲基化相对多见。HPV16LCR关键区域八个CpG位点的详细甲基化状态显示启动子区的甲基化较增强子多见。结论:1.与单纯感染相比,CIN中HPV16 LCR呈去甲基化状态,提示LCR去甲基化与宫颈瘤变的起始阶段相关。2.在宫颈癌中HPV16 LCR呈相对高甲基化,可能是宿主细胞防御病毒癌基因表达的反映。3.HPV16 LCR启动子区的甲基化检出率和CpG位点的甲基化频率高于增强子区,提示启动子区甲基化在调节病毒基因转录中发挥更重要作用。第四部分siRNA靶向HPV16启动子区诱导癌基因E6/E7的基因沉默目的:探索HPV16癌基因在转录水平沉默的途径方法:设计靶向HPV16 E6/E7启动子区的siRNA,并将siRNA转染入宫颈癌细胞株SiHa中,观察癌基因E6和E7的表达情况,细胞的生长、增殖和凋亡情况,以及HPV16启动子区的DNA甲基化情况。结果:E6/E7 mRNA和蛋白表达同步下降,细胞生长和增殖受到抑制,细胞凋亡和衰老增加(特别是细胞衰老),同时启动子区出现低水平的甲基化。结论:1.靶向HPV16启动子区的siRNA可在转录水平有效、同步沉默病毒基因E6和E7,并抑制细胞增殖和诱导其死亡。2.HPV启动子区在siRNA靶向干扰后仅呈低水平甲基化,提示siRNA介导的转录水平基因沉默可能受到甲基化外的表观遗传调控。