基于适配体纳米磁珠的黄曲霉毒素B1萃取及检测方法研究

来源 :西华大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zhuzhongbao2005
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郫县豆瓣有着悠久的历史和较高的知名度,享有“川菜之魂”的美誉。随着川菜的全面普及,郫县豆瓣的产销量也飞速增长,深受国内外消费者的喜爱。然而,郫县豆瓣目前仍然采用的是较为粗犷的自然发酵生产方式,这很容易产生黄曲霉毒素而导致严重的食品安全隐患问题。作为发酵食品,郫县豆瓣样品基质成分非常复杂,这对提取和检测其中的黄曲霉毒素带来了非常大的挑战。因此,为了解决这一难题,本论文制备了一种新型复合纳米材料用于豆瓣样品的预处理以萃取其中的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1),并在此基础之上构建了灵敏度高,准确度好,特异性强的AFB1检测方法?具体内容和结果如下:(1)建立了一种基于AFB1适配体和纳米磁珠Fe3O4的磁固相萃取方法。首先采用溶剂热法合成了纳米磁珠Fe3O4,硅酸四乙酯(TEOS)对磁珠表面包被二氧化硅,3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)提供氨基。采用X射线衍射(XRD)表征Fe3O4的晶型、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征Fe3O4的表面基团、透射电子显微镜(TEM)表征Fe3O4的表面形貌。通过戊二醛反应及亲和素-生物素反应将AFB1适配体组装到磁珠表面形成复合材料(Fe3O4@SiO2-apt),将该复合材料用于磁性固相萃取郫县豆瓣样品中的AFB1。通过对影响萃取效率的有关因素进行优化后,得到最佳萃取条件为:适配体磁珠用量5 mg,萃取时间30 min,洗脱时间5 min。在此最佳条件下,所建立的磁固相萃取方法对AFB1的萃取回收率为80.19%113.92%,此外,所制备的材料在重复使用两次后,对AFB1的萃取效率仍保持在80%以上,具有较高的重复使用价值。(2)以磁固相萃取方法作样品前处理,建立了一种基于AFB1适配体的杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)荧光检测法。首先设计了一条与AFB1适配体互补的单链DNA(complementary DNA,cDNA)以及两条发夹探针HP1(hairpin probe 1)、HP2(hairpin probe 2),其中HP1的末端修饰有荧光分子FAM。cDNA作为引发链引发HP1和HP2之间持续交替杂交组装形成带切口的聚合双螺旋DNA超长双链,该双链上的荧光分子产生的荧光不会被氧化石墨烯(GO)淬灭。当有AFB1存在时,适配体与AFB1结合,产生单链cDNA,引发HP1和HP2杂交产生增强的荧光信号。通过对有关条件进行优化后,得到最佳实验条件为:cDNA浓度50 nmoL/L,HP1、HP2浓度60 nmoL/L,杂交孵育时间60 min,氧化石墨烯浓度50μg/mL。在此条件下,该方法在260 ng/mL范围内具有良好的线性,R2=0.971,加标回收率为78.91%91.83%,相对标准偏差为3.24%6.05%。将该方法用于检测12种产自于不同生产厂家的豆瓣样品,发现10个样品中检出有AFB1,平均污染水平为3.42μg/kg,最高污染水平为4.50μg/kg,均未超出国家标准限量值5μg/kg。(3)建立了磁固相萃取-超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)测定郫县豆瓣中AFB1的检测方法。采用建立的磁固相萃取方法提取样品,电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,多反应监测(MRM)模式,外标法定量。优化质谱条件和液相条件后,在最佳条件下得到方法检出限为0.08 ng/mL,定量限为0.25 ng/mL,线性范围为0.3950 ng/mL,R2=0.997,添加回收率为85.78%93.36%。将该方法与杂交链式反应检测法进行比较,得到两种方法的相关性为0.9608,表明两种方法的准确性较好,可用于实际样品中检测。
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