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背景据WHO统计,全球育龄的妇女不孕率达10%-15%[1],盆腔因素引起的不孕约占35%,其中慢性输卵管炎引起输卵管解剖和功能的破坏导致的不孕是临床常见的原因。传统药物和手术治疗可能对轻症或早期输卵管炎症损伤有一定疗效,但很大一部分患者最后依靠辅助生殖技术(assisted reproductive techniques,ART)。随着试管婴儿出生率的增加,ART面临其所伴随的并发症、新生儿出生缺陷风险以及不良围产期结局较自然状态受孕高的风险和挑战。因此,我们有必要继续探索新的修复输卵管炎性损伤,恢复其生殖功能的方法,力求配子(精子/卵子)在自然状态下结合并生长发育。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其在更新和分化上的独特魅力,日渐成为干细胞治疗的掌上明珠,其中人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUC-MSCs)被进一步证实更具临床优势,独特的低免疫原性,含量极其丰富,可以无创获取。hUC-MSCs移植治疗研究发现其独特的抗炎及抗纤维化作用能促进组织修复和再生,可作为细胞移植治疗的首选。但hUC-MSCs因自身作用的局限性,比如潜在的致瘤性等,限制了其在临床上的广泛性应用。近年来深层次研究MSCs的作用机理时发现MSCs“旁分泌”机制在疾病的治疗中发挥着重要的作用,因此MSCs分泌因子日益成为研究的焦点。外泌体(exosomes)是体内活细胞分泌的一种膜性小囊泡,是亚细胞结构复合体,可介导细胞相互间信息的传递。外泌体比细胞分泌的其它囊泡生物学特性清晰明确,应用优势明显:化学性质更稳定、能高效修复受损组织、组织选择性高、靶向性投递、易于保存方便运输。研究发现MSCs分泌的外泌体能发挥MSCs的部分生物学功能效应,被证实能治疗临床多种疾病。本研究将hUC-MSCs来源外泌体用于输卵管慢性炎性损伤的SD大鼠模型的干预治疗,从输卵管结构、分泌功能、受孕率的变化评价人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymalstem cells exosomes,hUC-MSCs-Ex)的生物学效应,为输卵管炎性不孕的治疗探索新的具有广泛临床应用前景的途径。第一章hUC-MSCs来源外泌体的制备及鉴定目的:探索优化的hUC-MSCs-Ex的制备方法,并制成方便应用的冻干粉。方法:本实验通过组织块直接贴壁法进行分离,培养得到hUC-MSCs,同时对其获得的细胞进行形态学鉴定、细胞表面特异性标志物与细胞多向分化能力的综合鉴定。改良的差速离心法制备hUC-MSCs-Ex,透射电镜鉴定其形态,Bradford蛋白定量法定量检测,SDS-PAGE凝胶电泳初步分析蛋白分子量及大小,Western Blot鉴定标志蛋白CD63、CD81;通过冻干法将hUC-MSCs来源外泌体制成冻干粉保存。结果:本实验通过组织块直接贴壁法进行分离,培养得到hUC-MSCs;经改良过的差速离心法制备的hUC-MSCs-Ex,透射电镜下观察形态结构,呈圆形或椭圆形囊泡状结构,直径在30-100nm,胞膜完整,胞内为低电子密度成分;表达标志性蛋白CD63、CD81;成功获得hUC-MSCs-Ex冻干粉。结论:经过改良的差速离心法制备的hUC-MSCs来源的外泌体的纯度较高,可冷冻干燥成冻干粉,为后续的体内外实验提供了相对更加稳定可靠的移植源。第二章hUC-MSCs来源外泌体体外炎症实验目的:通过体外巨噬细胞RAW264.7构造细胞炎症模型,检测hUC-MSCs-Ex体外对炎症的作用。方法:LPS刺激巨噬细胞RAW264.7构造体外细胞炎症模型,实验分5组,(1)空白对照组(NC):不添加任何药物处理;(2)LPS模型组(LPS):0.1μg/ml LPS刺激;(3)exosomes低浓度组(Ex-L):0.1μg/ml LPS刺激后添加15μg/ml的exosomes;(4)exosomes中浓度组(Ex-M):0.1μg/ml LPS刺激后添加45μg/ml的exosomes;(5)exosomes高浓度组(Ex-H):0.1μg/ml LPS刺激后添加135μg/ml的exosomes。Western blot检测各组炎症因子肿瘤坏死因子-α的表达情况。结果:hUC-MSCs-Ex能够下调炎症因子肿瘤坏死因子-α的表达,对LPS诱导的体外炎症反应具有抑制效果,且随着外泌体作用浓度的增加,抑制作用越明显,呈剂量依赖性抑制。结论:hUC-MSCs-Ex能有效抑制LPS诱导的体外炎症反应。第三章SD雌性大鼠慢性输卵管炎症模型的建立目的:用3×10~8/ml大肠埃希菌(单一菌)悬液注入SD雌性大鼠双侧输卵管建立输卵管慢性炎症动物模型。方法:制备3×10~8/ml大肠埃希菌(单一菌)悬液,40只SD雌性大鼠随机分两组,其中正常组10只、大肠埃希菌液实验组40只。手术打开腹腔将大肠埃希菌悬液注入SD雌性大鼠双侧输卵管。于手术后的第5天、10天、15天和20天分别取材,观察输卵管炎症形成情况。结果:大肠埃希菌液实验组大鼠于手术后第15天表现为输卵管慢性炎症改变。结论:大肠埃希菌(单一菌)可以使SD雌性大鼠输卵管发生炎症反应,能成功建立输卵管慢性炎症模型。第四章hUC-MSCs来源外泌体对慢性输卵管炎性损伤大鼠干预和评估目的:通过腹腔注射hUC-MSCs-Ex治疗慢性输卵管炎症SD雌性大鼠动物模型,综合评估hUC-MSCs-Ex对慢性输卵管炎性不孕大鼠的治疗效果。比较正常组和治疗组心、肝、肾重要脏器的的结构和功能的变化,了解本实验治疗剂量下hUC-MSCs-Ex对SD大鼠的安全性。方法:3×10~8/ml大肠埃希菌(单一菌)悬液注入SD雌性大鼠双侧输卵管建立输卵管慢性炎症动物模型,实验分为4组(每组n=20):(1)Sham组(假手术组),不予药物处理;(2)M组(模型对照组),建模第15天开始腹腔注射0.9%氯化钠注射液,0.5ml/只/天,共2周;(3)Ex-A组(建模同时给药组),建模第2天开始用hUC-MSCs-Ex冻干粉以0.9%氯化钠注射液稀释,浓度为120μg/ml,剂量为0.5ml/只/天,腹腔注射共2周;(4)Ex-B组(建模后给药组),建模第15天开始用0.9%氯化钠注射液稀释hUC-MSCs-Ex冻干粉,浓度为120μg/ml,剂量为0.5ml/只/天,腹腔注射共2周。治疗2周后每组各处死一半大鼠(即每组10只)取血及输卵管、心、肝、肾标本。Elisa检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ浓度,光镜和电镜下观察输卵管结构改变,Westernblot和实时荧光定量PCR检测输卵管组织中DPF-1及其mRNA的变化,Masson染色观察输卵管纤维化情况;各组剩余10只大鼠分别与雄性大鼠比较妊娠率和产仔数。同时比较各组大鼠之间的生化指标,光镜下观察各组大鼠心脏、肝脏、肾脏的结构。结果:Ex-A组和Ex-B组大鼠在移植hUC-MSCs-Ex后,输卵管的结构恢复。Ex-A组和Ex-B组的输卵管胶原纤维增生较M组均显著减少(P<0.05);Ex-A组和Ex-B组的DPF-1及其mRNA量较M组均有不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Ex-A组的肿瘤坏死因子-ɑ浓度较M组明显降低(P<0.05);Ex-B组大鼠血清中的肿瘤坏死因子-ɑ浓度较M组有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。Ex-A组大鼠血清中干扰素-γ浓度较M组明显下降,具有显著性差异(P<0.05),Ex-B组血清中干扰素-γ浓度较M组有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。Ex-A组与Ex-B组相比,干扰素-γ浓度略低,但差异无统计学意义(P>0.05)。Ex-A同笼组和Ex-B同笼组的妊娠率均为100%,Ex-A组平均产仔数比M组产仔数明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Sham组比较产仔数多且差异有统计学意义(P<0.05)。Ex-B组受孕率为100%,平均产仔数与M组相比,Ex-B组产仔数增多,差异具有统计学意义(P<0.05),与Sham组比较产仔数减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。Ex-A组比Ex-B组产仔数稍增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠的生化指标均在正常范围内,各组大鼠的心脏、肝脏、肾脏结构正常。结论:hUC-MSCs-Ex一定程度上能恢复慢性输卵管炎SD雌性大鼠的生殖能力。本实验治疗剂量hUC-MSCs-Ex未发现改变SD大鼠心脏、肝脏、肾脏的结构和功能,是安全的。