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本研究采用RT-PCR技术先扩增出5个鸡品种的β-防御素共68个cDNA序列,接着从体内H9N2病毒感染实验和体外原代培养细胞LPS刺激实验两个角度研究鸡防御素的诱导表达情况,为鸡β-防御素的开发应用打下了良好的基础。
1、用所设计的引物,采用RT-PCR技术特异性地扩增到5个鸡品种β-防御素基因共65个基因片段,除Gal-3外,其它的p.防御素基因都包括了编码区全长片段。通过克隆、测序获得68个基因的cDNA核苷酸序列。本研究在清远麻鸡、广西黄鸡和胡须鸡中扩增到了Gal.1与Gal一1(α),但在竹丝鸡和杏花鸡中只检测到Gal.1,未检测到Gal一1(α)基因。
2、比较分析了不同的鸡品种的β-防御素在核苷酸水平和氨基酸水平的差异,不同鸡品种的p.防御素的个别氨基酸残基存在差异,其同源性在95.5%~100%之间。进一步分析有差异的防御素的成熟肽的pI值和ch值,发现检测的5个中国地方品种鸡的p一防御素成熟肽的pI值和ch等于或大于GenBank中注册的品种的成熟肽的pI值和ch值。
3、采用RT-PCR技术检测了β-防御素基因在广西黄鸡、竹丝鸡、杏花鸡、清远麻鸡、胡须鸡等5个地方鸡种各组织中的分布。结果表明,Gal.1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal.10的分布广泛,在几乎所有的检测组织都有表达,同时个体差异较大;Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-1l、Gal-12和Gal.13的分布有组织特异性,但品种间和个体间的差异小。
4、对H9N2病毒诱导鸡p.防御素基因在体内的表达情况进行研究,结果表明:(1)广西黄鸡Gal-4在法氏囊组织中的表达受到H9N2病毒感染的诱导,而其它β-防御素基因的表达受H9N2病毒感染的影响不大;(2)感染H9N2病毒后,竹丝鸡的多个组织的防御素基因表达被抑制,包括Gal-5基因在十二指肠中的表达,Gal-6基因在喉气管组织的表达,Gal-7在喉气管和十二指肠的表达,只有Gal-8在法氏囊组织中的表达受诱导;(3)感染H9N2病毒后,清远麻鸡Gal-4基因在十二指肠中的表达和Gal-5、Gal-7基因在肝脏组织中的表达受诱导,而Gal-5基因在肾脏组织中的表达、Gal-7基因在喉气管组织中的表达和Gal.10基因在肺脏的表达被抑制;(4)杏花鸡的Gal-5基因在十二指肠中的表达、Gal-7基因在肝脏组织的表达受到H9N2病毒感染的诱导,而Gal-7基因在十二指肠中的表达受到抑制;(5)胡须鸡在感染H9N2病毒后,Gal-3基因在喉气管组织的表达、Gal-4基因在喉气管组织中的表达、以及Gal-5基因在肝脏组织中的表达受到诱导,而没有防御素基因的表达受抑制。
5、成功地进行了鸡喉气管上皮细胞、肺上皮细胞、肝脏细胞、十二指肠上皮细胞、回肠上皮细胞、肾脏细胞、法氏囊细胞、淋巴细胞和骨髓细胞的体外培养。体外诱导表达试验表明,在体外培养的原代细胞中添加LPS(100p,g/mL)可以诱导多种防御素基因表达。包括Gal.1基因在法氏囊细胞中的表达、Gal-2基因在肾脏细胞中的表达、Gal~4基因在肾脏细胞、肺脏细胞和淋巴细胞中的表达、Gal-5基因在肝脏细胞、法氏囊细胞和淋巴细胞的表达、Gal-6、Gal-7在法氏囊细胞中的表达受LPS诱导表达;而Gal一1基因在回肠细胞的表达和Gal-7基因在淋巴细胞的表达受到LPS的抑制。