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乙烯是一种重要的植物激素调控了植物生长发育的诸多方面,包括种子萌发、果实成熟、根毛的发育以及植物对生物胁迫和非生物胁迫的反应。我们多年来一直从事烟草乙烯受体NTHK1的研究,NTHK1是一个细胞膜定位的丝苏激酶受体,体外的磷酸化分析表明GAF-HisATP区域是具有磷酸化活性最小的单位,通过在烟草和拟南芥过量表达分析表明,NTHK1调控了植物对盐胁迫的反应。本实验以酵母双杂交的方法对NTHK1的相互作用蛋白进行了筛选,并对相互作用蛋白的功能进行了初步的分析。
运用CytoTrap酵母双杂交系统筛选到了两个与NTHK1相互作用的蛋白,分别命名为Nip1和Nip2(NTHK1-interacting protein)。我们主要对Nip2的功能进行了深入的研究。Nip2全长为1392 bp,其中ORF为1053 bp,编码305个氨基酸。在N端含有一个PEST domain,C端含有3个ankyrindomain的重复序列。通过Tail-PCR方法我们克隆得到了Nip2基因的启动子,其长度为845 bp。在乙烯和AVG处理下,Nip2在mRNA水平上的变化不是很明显,Nip2蛋白水平在ACC处理下受到蛋白酶体的降解,而在AVG条件下蛋白水平表达量升高。
体外的GST pull down和体内的CO-IP实验也证明了Nip2与NTHK1的相互作用。在酵母的结合实验中,通过对不同区段的NTHK1和Nip2的结合分析发现,Nip2 C端的ankyrin domain介导了与NTHK1激酶区(His-ATPase)的相互作用。体外的磷酸化实验也表明,NTHK1可以磷酸化Nip2。
在Nip2转基因烟草中,RNAi的烟草表现为植株矮小、叶黄化有白色斑点和根短等表型;而过量表达的烟草表现为大叶子表型,这与NTHK1过表达烟草的表型相似。另外,在三重反应实验中,RNAi的植株表现为对乙烯的敏感,而过表达植株表现为对乙烯的不敏感反应。这说明Nip2在调控植物的生长与植物对乙烯的反应中与NTHK1起着类似的功能。但是在转基因烟草对逆境胁迫盐和甲基紫精的反应中,RNAi的植株表现为对胁迫的敏感反应,而过表达的烟草表现为对盐胁迫的抗性反应,这与NTHK1在调控植物对盐胁迫反应的作用是相反的。这种现象可能是由于NTHK1可能调控了Nip2的表达造成。