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第一部分：巨噬细胞极化与主动脉瓣膜钙化的相关性研究目的：收集人体瓣膜标本,鉴定M1、M2型巨噬细胞,比较钙化瓣膜与正常瓣膜之间M1、M2差异。RT-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-12α、TGF-β1、IL-10和AMAC-1细胞因子表达情况。方法：根据《赫尔辛基宣言》和知情同意原则收集人体主动脉瓣膜标本。依瓣膜病变程度的轻重拟定瓣膜钙化分级,0、1、2、3共四级。对照组瓣膜为0级,取自无瓣膜病变的急性主动脉夹层者、无瓣膜病变的心脏移植受体心以及配型失败的供心。实验组瓣膜钙化为1-2级,取自因主动脉瓣退行性病变行瓣膜置换者,瓣膜明显增厚、钙化。一部分瓣膜标本固定、包埋、切片后行免疫组化染色鉴定；另一部分标本直接液氮保存。结果：免疫组化染色结果显示,实验组和对照组主动脉瓣膜中：①巨噬细胞浸润密度(细胞数/mm2)分别为(52.6±29.6,N=20),(22.5±16.0,N=14),P<0.05,具有统计学意义。②M1型巨噬细胞浸润密度分别为(48±30.0,N=20),(5.43±6.70,N=14),P<0.05,具有统计学意义。③M2型巨噬细胞浸润密度分别为(10.75±13.2,N=20),(20.79-±：14.5,N=20)P=0.0567,结果不具有统计学意义。④M1所占总巨噬细胞比例分别为0.941±0.246,0.297±0.301,P<0.05,具有统计学意义。⑤M2所占总巨噬细胞比例分别为0.251±0.254,0.945±0.112,且P<0.05,具有统计学意义。RT-PCR检测M1型细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12α与M2型细胞因子TGF-β1、IL-10和AMAC-1。实验组表达水平均较对照组高,其中TGF-β1、IL-12α、IL-10、AMAC-1,P<0.05,具有统计学意义。TNF-α和IL-6的P值大于0.05,不具统计学意义。结论：增厚钙化主动脉瓣膜中,巨噬细胞含量增高。实验组以M1型巨噬细胞浸润为主,对照组以M2型巨噬细胞为主。提示M1型巨噬细胞同主动脉瓣膜钙化可能存在相关性。细胞因子结果表明,实验组TGF-β1、IL-12α、IL-10、AMAC-1等细胞因子较对照组均增高,说明瓣膜钙化可能是多种炎症因子参与作用的结果。第二部分：巨噬细胞诱导VICs钙化及机制研究第一节：体外诱导巨噬细胞极化和VICs钙化目的：刺激U937单核细胞为巨噬细胞,并分别诱导其向M1、M2极化。收集人主动脉瓣膜临床标本,体外分离培养VICs,使用钙化培养基诱导其钙化。方法：PMA刺激U937单核细胞分化为巨噬细胞。不同浓度LPS和IL-4分别刺激巨噬细胞,WB和RT-PCR检测M1、M2型相关标志性蛋白。从临床瓣膜标本中分离培养瓣膜间质细胞(VICs),钙化培养基培养7天后检测BMP2, ALP等钙化相关蛋白,14天后检测钙化斑块形成。结果：U937人单核细胞经PMA刺激后分化为巨噬细胞。经LPS刺激后,iNOS表达上调,经IL-4刺激后,Arg-1和TGF-β表达上调。分离并鉴定人主动脉瓣膜VICs,表型鉴定结果为a-SMA (+)> vimentin (+)。钙化培养基培养7天后检测钙化相关因子ALP、BMP2等明显增高,与正常培养基相比,ALP升高5.1-0.23倍,BMP2升高3.51±0.24倍,P<0.05,具有统计学意义。14天后行茜素红染色,见明显钙结节染色,证明钙化培养基诱导VICs钙化效果可靠。结论：U937细胞人单核细胞分化的巨噬细胞,经LPS/IL-4刺激建立M1/M2细胞模型。分离培养VICs,钙化培养基诱导建立VICs钙化模型。第二节：SOCS蛋白与巨噬细胞极化的联系目的：探讨SOCS3和SOCS2是否参与人巨噬细胞极化。方法：将U937单核细胞诱导为巨噬细胞,给予不同浓度LPS刺激,检测SOCS3表达。给予不同浓度IL-4刺激,检测SOCS2表达。SOCS3病毒,转染巨噬细胞后,给予LPS刺激,观察M1型巨噬细胞相关细胞因子变化。结果：LPS可上调巨噬细胞iNOS表达,诱导其M1型分化。同时,LPS可增加巨噬细胞SOCS3蛋白表达,且SOCS3表达趋势与iNOS高度一致。IL-4可上调巨噬细胞Arg-1表达,诱导其向M2型分化。同时,IL-4可增加SOCS2蛋白表达。SOCS3转染实验结果表明：巨噬细胞转染SOCS3病毒后,相同浓度LPS刺激可明显上调iNOS和TNF-α表达。结论：M1型、M2型巨噬细胞的极化与SOCS3、SOCS2蛋白密切相关。上调SOCS3蛋白可诱导巨噬细胞M1型极化。第三节：M1型巨噬细胞促进VICs钙化的研究目的：探讨巨噬细胞M1型极化是否促进VICs钙化及相关机制。方法：用PMA诱导U937单核细胞分化巨噬细胞。LPS500ng/ml刺激巨噬细胞,12小时。流式细胞仪检测M1型巨噬细胞比例。重复上述实验,留取细胞上清液,深低温冰箱冻存,备用。选取第3-5代VICs,种植于六孔板,分组如下：A组为对照组,1640培养基lm1+钙化培养基1血；B组为PMA刺激的巨噬细胞上清液1m1+钙化培养基1ml；C组为经LPS和PMA联合刺激后的巨噬细胞上清液1m1+钙化培养基lml。7天后行RT-PCR以及Westen Blot检测相关钙化指标ALP、BMP2、OPN和TNF-α。结果：经LPS刺激后可明显上调M1型巨噬细胞比例。经PMA和LPS刺激的巨噬细胞上清液与VICs共培养,可明显上调ALP、BMP2、OPN表达。结论：M1型巨噬细胞极化可促进VICs钙化。