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目的:
1、研究分析早发冠心病患者的传统危险因素、脂类代谢情况、冠状动脉病变特点。
2、研究散发早发冠心病患者中MEF2A Exon 7和Exon 11以及ACE 16Intron基因突变情况。
3、进一步研究不同早发冠心病家系遗传特点,进而明确MEF2A和ACE基因突变与早发CAD的相关性。
4、研究早发冠心病患者中eNOS和ET-1水平的改变,进而明确内皮功能异常与早发CAD发病之间的联系。
5、研究不同相关脂蛋白对内皮细胞MEF2A表达水平的影响。
6、构建MEF2A真核表达载体,并明确该表达载体在细胞中能进行相应蛋白表达。
方法:
1、收集临床资料,血管造影结果,对早发冠心病患者、非早发冠心病患者和非冠心病患者的传统危险因素、脂类代谢情况、冠状动脉病变特点进行统计分析。
2、在基因水平,采用片断长度多态性和直接测序的方法对所有研究对象(包括家系及散发病例)ACE 16Intron和MEF2A Exon 7和Exon 11的突变情况进行分析。
3、在蛋白水平,采用ELISA方法对所有研究对象外周血中eNOS水平和ET-1水平进行检测。
4、在mRNA水平,采用实时荧光定量反转录PCR方法研究不同浓度LDL、HDL对内皮细胞MEF2A表达水平的影响。
5、在细胞水平,采用质粒构建、真核细胞转染的方法明确特定MEF2A片断在真核细胞中表达状况。
结果:
1、早发CAD临床特点:①传统危险因素显著少于非早发CAD;②吸烟和阳性家族史比率显著高,高血压比率显著低;③TG水平显著高;④以急性冠脉综合症起病为主,并且以单支血管受累为主;⑤病例平均病变积分较低,轻度病变比率较高。有统计学意义。
2、以非早发CAD病例为参照,对早发CAlD进行冠心病传统危险因素Logistic回归发现早发CAD病例中阳性家族史对导致疾病起显著作用,吸烟起很重要的作用。
3、成功收集早发冠心病大家系2个,小家系3个。
4、在我国汉族人群中,MEF2A Exon 7基因变异与早发CAD没有相关性。
5、MEF2A Exon 11上发现有5个多态性位点:①1258~1290(cAG)n(n=4~11),其CAG重复数的改变对早发CAD的发生可能没有作用;②1291~1293CCG/-,其DD/DW基因型和D等位基因与CAD尤其是早发CAD的发生有关;③1303C/T为新发现的位点,在既往研究中从未报道;④1305G/A,其多态性与早发CAD没有相关性;⑤1353G/T,其TT基因型和T等位基因对早发CAD和CAD的发生有关。MEF2A Exon 11的1291~1293CCG/-,1305G/A和1353G/T三个位点各组间的分布均存在连锁不平衡或强不平衡。1291~1293 CCG D+1305 G+1353T单倍型对早发CAD的发生明显相关。
6、ACE 16Intron I/D多态位点的DD基因型和D等位基因与CAD的发生有关,但其与早发CAD的关系有待进一步扩大样本量证实。
7、在PCADLG01家系中,MEF2A Exon 11的1291~1293CCG/-DW杂合突变型和1353 G/T的TT纯合突变很有可能是导致其众多家系成员发生早发CAD的病因。然而MEF2A Exon 11和ACE 16Intron的突变在另外几个家系中没有明显相关性。
8、eNOS水平:①早发CAD组<非早发组<正常对照组,有显著差异;②其与病变严重程度和病变血管支数呈负相关,但是未达到统计学显著意义;③与吸烟状态呈显著负相关;④去除吸烟的混杂因素后,eNOS水平在三组间仍然有显著差异(早发CAD组<非早发组<正常对照组)。
9、ET-1水平:①早发CAD组>非早发CAD组和正常对照组,有显著差异;②非早发组>正常对照组,但未能达到统计学显著差异;③其与病变严重程度和病变血管支数呈正相关,但未达到统计学显著意义。
10、eNOS水平和ET-1水平的关系:呈负相关性,有统计学意义。
11、体外细胞学实验,用荧光定量RT-PCR检测MEF2A表达水平:①证实荧光定量RT-PCR是一种新的更为灵敏、高效的研究手段来探讨危险因素对心血管系统相关基因表达的影响;②人脐静脉内皮细胞中MEF2A的表达显著高于外周血细胞;③LDL刺激能显著降低人脐静脉内皮细胞MEF2A基因的表达水平,HDL作用与其相反。作用内皮细胞6 h和12 h此效果不显著,24 h后明显,该作用呈明显的剂量依赖性。
12、成功构建的MEF2A真核表达载体在内皮细胞等细胞中均可以表达。
结论:
1、本实验从临床水平观察到:较非早发CAD,早发CAD的传统危险因素较少,吸烟、冠心病阳性家族史和TG水平升高可能在其发生过程中起了很重要的作用。早发CAD往往发病较急,侧支循环来不及建立,预后较差。
2、本实验从基因水平发现:国外已报道的MEF2A Exon 7多态性位点与在我国汉族人群早发CAD的发生无明显相关;但MEF2A Exon 11多个多态性位点与早发CAD的发生明显相关;ACE 16Intron的多态性与CAD的发生明显相关,但是与早发CAD的关系有待进一步扩大样本量证实。早发CAD在不同人群,不同家系中具有遗传异质性。
3、本实验从血清学水平观察到:早发CAD组eNOS较低,ET-1水平较高,内皮功能失调很可能是引起早发CAD的病理基础。
4、LDL、HDL除了在脂质代谢中起作用外,还可能会影响MEF2A基因的表达。
5、可以将MEF2A载入到真核表达载体,并在内皮细胞中表达,将来完全可以以此方法对不同变异基因型MEF2A致早发CAD机制进行研究。