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背景与目的1型1磷酸鞘氨醇受体(Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1)是G蛋白偶联受体超家族表达最多和最广泛的受体之一,在成人体内高表达于免疫器官、肺和脑等组织,在肾脏中表达较低。利用抗S1P1抗体对小鼠胸腺进行免疫组织化学染色显示,S1P1主要在胸腺髓质区的胸腺细胞表面表达。胸腺髓质区分布的细胞主要是单阳性胸腺细胞,Michael A等认为单阳性T细胞从胸腺迁出是由其高表达的S1P1与S1P特异性识别结合介导的。S1P1的表达受转录因子叉头蛋白O1(Forkhead Box transcription O1,FoxO1)的调控。在哺乳类动物中,FoxO1高表达于成熟的T、B淋巴细胞,并且可以调节T细胞的分化及功能。FoxO1在胸腺细胞发育为单阳性细胞的早期表达升高,引起S1P1的表达,直至胸腺细胞成熟迁出胸腺。项目组前期关于重症肌无力(myasthenia gravis,MG)的研究发现在MG患者胸腺组织中转录因子FoxO1和S1P1在RNA水平和蛋白水平均高于正常对照组,提示FoxO1可能通过调节S1P1表达与MG的发生发展有关。S1P/S1P1通过对胸腺细胞输出的调节,使成熟胸腺细胞在胸腺内数量与外周T细胞库内数量保持动态平衡,以维持正常的免疫功能。在某些炎症性疾病和自身免疫病中,S1P/S1P1会导致胸腺细胞的迁出异常。重症肌无力是一种乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)抗体介导、T细胞依赖的自身免疫病,胸腺功能异常与MG的发生发展密切相关。部分MG患者手术切除胸腺后,症状明显减轻。通过检测MG患者和正常人胸腺组织中S1P1mRNA水平,发现MG胸腺组织中S1P1 mRNA水平显著增高;免疫组化同样显示S1P1的蛋白表达水平在MG胸腺中显著高于正常对照组。S1P1不仅介导成熟胸腺细胞的输出,在对S1P/S1P1在T细胞非迁移功能方面的作用研究发现,S1P/S1P1还可以通过G蛋白介导的信号通路影响胸腺细胞的分化成熟。S1P1转基因小鼠中转录因子如c-maf,JunB,Gata3高水平激活,导致IL-4升高和IFN-γ降低,使初始T细胞向Th2细胞分化,也可以通过IL-6诱导Th17的产生,也可以通过激活Akt-mTOR通路负性调节Treg细胞在胸腺内的分化发育。本研究以EAMG模型鼠为基础,研究S1P1与FoxO1的关系和S1P1对CD4+CD8-SP胸腺细胞向Th17分化及其IL-17等细胞因子表达的影响。方法1.建立EAMG大鼠模型:6-8周雌性Lewis大鼠,利用AchR多肽多点皮内(背部皮肤和下肢足垫)注射免疫3次。取眼眶血分离血清,ELISA法测抗AchR抗体,选取阳性大鼠进行实验。2.EAMG大鼠胸腺和淋巴结T细胞亚群及S1P1表达分析:分离EAMG大鼠胸腺和淋巴结,分别制备胸腺细胞和淋巴结T细胞悬液,采用流式细胞术检测胸腺细胞和T淋巴细胞亚群及其S1P1和FoxO1的表达;利用免疫组织化学染色分析S1P1和FoxO1在胸腺及淋巴结组织中的表达。3.大鼠骨髓衍生树突状细胞(DCs)的诱导和培养:分离大鼠长管状骨,冲洗骨髓腔获取骨髓细胞悬液,利用IL-4和GM-CSF诱导使其分化为DCs。4.CD4单阳性胸腺细胞(CD4SP)的分选:采用流式细胞术从胸腺细胞悬液中分选出不含Treg(CD4+CD8-CD25+CD127+/-)的CD4+CD8-胸腺细胞。5.DCs与CD4SP胸腺细胞共培养:按照DCs与CD4SP细胞1:10的比例将两种细胞进行共培养。7天后,加入S1P或FYT720作用6h,流式细胞术检测细胞因子的表达变化。4.FoxO1对Jurkat细胞S1P1表达的影响:构建FoxO1表达和干扰慢病毒,感染Jurkat细胞120h,通过荧光定量PCR、WB和流式细胞术检测FoxO1对S1P1表达的影响。结果1.EAMG模型:Lewis大鼠经过3次AchR多肽免疫后,体重明显下降,功能评分升高,EAMG组的AchR抗体滴度明显高于对照组(P<0.05),说明EAMG大鼠模型建立成功。2.EAMG大鼠胸腺和淋巴结T细胞亚群及S1P1的表达:EAMG大鼠胸腺CD4-CD8-细胞、CD4+CD8+细胞和SP细胞(CD4+CD8-细胞和CD4-CD8+细胞)无明显改变,P>0.05;CD4+CD8-SP胸腺细胞中Treg细胞(CD4+CD8-CD25+CD127+/-胸腺细胞)没有显著改变(P>0.05),Th17细胞(CD4+CD8-IL-17+胸腺细胞)显著增多,P<0.05;S1P1+CD4-CD8-细胞和S1P1+CD4+CD8-细胞增多,P<0.05;S1P1+CD4+CD8+细胞和S1P1+CD4-CD8+细胞无明显改变,P>0.05;CD4+CD8-SP胸腺细胞中S1P1+Treg细胞和S1P1+Th17细胞均无明显改变,P>0.05。FoxO1+CD4-CD8-细胞和FoxO1+CD4+CD8-细胞增多P<0.05。EAMG大鼠淋巴结中T细胞组成CD4+T细胞和CD8+T细胞均无明显改变(P>0.05),两个亚群细胞均表达S1P1和FoxO1;Treg细胞减少(P<0.05),Th17细胞无明显改变。对模型大鼠的胸腺和淋巴结进行S1P1和FoxO1的免疫组织化学染色同样证明S1P1主要表达于EAMG大鼠的胸腺髓质区。3.S1P对CD4SP细胞分泌IL-17和IL-22的影响:CD4SP胸腺细胞与DCs共培养7天后,经S1P和FTY720刺激6h,IL-17、IL-22显著增加(P<0.05)。4.FoxO1对Jurkat细胞S1P1等分子表达的影响:FoxO1过表达慢病毒于感染Jurkat细胞120h后,FoxO1、KLF2、S1P1和CD62L mRNA水平显著增高(P<0.05),FoxO1、p-FoxO1和KLF2胞浆蛋白水平增高,S1P1+细胞和CD62L+细胞比率增高(P<0.05),CCR7+细胞和CD69+细胞未见显著改变(P>0.05)。FoxO1干扰组于转染后120h FoxO1、KLF2、S1P1和CD62L mRNA水平降低(P<0.05),FoxO1、p-FoxO1和KLF2胞浆蛋白水平低于对照组,S1P1+细胞百分比增多(P<0.05),但S1P1+细胞和CD62L+细胞在72h时减少(P<0.05)。结论S1P1通过与其配体S1P结合促进EAMG大鼠CD4SP胸腺细胞分泌IL-17等炎症性细胞因子,而S1P1的表达受转录因子FoxO1正调控。