酸橙主要分布于四川、重庆、湖南、江西等地,源于酸橙不同采收期的药材有枳实和枳壳,枳实5-6月采收,枳壳7月果皮尚绿时采收。“川枳实、川枳壳”品质佳,行销全国各地,是四川的道地药材之一。“湘枳实、湘枳壳”发展很快,产量大,是全国商品生产基地。江西枳实、枳壳以清江县黄岗和新干县三湖洲的最著名,为传统道地药材。枳实、枳壳来源相同,而不同的采收期又使两药在作用部位、作用强度等方面各有特性。如同为理气药,中医认为枳实专利低位性气滞,而枳壳专利高位性气滞；枳实力猛,枳壳力缓。现行药典标准对枳实以辛弗林为质控指标,对枳壳以柚皮苷和新橙皮苷为质控指标,并未体现二者在功效上的共性与特性。由于质量评价体系不完善,有关酸橙果实不同采收期成分系统分析比较研究未见相关报道。本研究对酸橙果实(5月至9月,每半月采摘一次)首次进行了从植株挂果到果实成熟的整个生长期的研究,并以主要活性成分黄酮类、生物碱类、酚酸类、柠檬苦素等为指标,系统研究酸橙果实整个生长期内化学成分动态变化规律,为酸橙枳实、枳壳采收期的制定及质量评价体系的完善提供实验依据。研究内容及结果如下：1.酸橙果实不同采收期化学成分比较研究对酸橙果实不同采收期黄酮类成分、生物碱、总酚酸、柠檬苦素的含量变化进行了对比分析,以期为酸橙枳实、枳壳药材采收期的制定提供实验依据。1.1黄酮类成分枳实及枳壳药材中所含黄酮类成分主要以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等为主,本研究采用HPLC法和UV法分别测定上述4种黄酮苷及总黄酮含量。结果表明：随着酸橙果实成熟度的增加,总黄酮含量从41.13%降至8.28%,其中橙皮苷和新橙皮苷的含量呈现递减的变化趋势,而芸香柚皮苷和柚皮苷的含量呈现先增加后降低的变化趋势。黄酮类成分间存在何种转化关系有待进一步研究。1.2生物碱类成分采用HPLC法和UV法分别测定药材中辛弗林和总生物碱的含量。结果表明：随着酸橙果实成熟度的增加,总生物碱和辛弗林的含量均呈现递减的变化趋势,其中总生物碱含量从10.35%降至1.2%,辛弗林含量从0.79%降至0.22%。1.3总酚酸文献报道,酚酸类成分不仅具有抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化以及预防心血管疾病的作用,而且还具有抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能。目前,枳实、枳壳中酚酸类成分研究较少,本研究首次比较分析了酸橙果实不同采收期药材中总酚酸含量变化规律。随着酸橙果实成熟度的增加,总酚酸的含量从8.73%递减至0.55%,研究结果为酸橙果实中酚酸类提取物原药材选择提供了实验依据。1.4柠檬苦素柠檬苦素作为苦味物质,在柑橘属果皮中普遍存在。文献报道具有抗炎、镇痛、抗癌等广泛的药理活性,本研究采用HPLC法,首次比较分析了酸橙果实不同采收期药材中柠檬苦素含量变化规律。随着酸橙果实成熟度的增加,柠檬苦素含量在6月中旬最高(0.5%),随后呈现先下降后升高再下降的变化,9月初的药材中含量最低(0.26%),研究结果为酸橙果实中柠檬苦素提取物原药材选择提供了实验依据。以上结果表明,随着酸橙果实成熟度的增加,总黄酮、总生物碱、总酚酸、橙皮昔、新橙皮苷、辛弗林的含量均呈现递减的变化趋势；柚皮苷、芸香柚皮苷的含量呈现先增加后降低的变化趋势；柠檬苦素的含量呈现先升高,随后下降再升高再下降的波动变化。研究结果为酸橙枳实、枳壳采收期的制定提供了实验依据。2.枳壳药材不同部位化学成分比较研究雷敩最先提出枳壳用时先去瓤,明代陈嘉谟认为“去瓤免胀”。且核瓤极易发霉、虫蛀、变质,炮制过程中筛去核瓤。既往文献报道中,尚无关于枳壳果皮、核瓤不同部位有效成分含量比较研究。本研究比较分析了枳壳果皮、核瓤中黄酮类和生物碱类成分含量。结果,枳壳果皮与核瓤中均存在芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林等有效成分,且果皮中的含量高于核瓤。枳壳核瓤中尚存在多种有效成分,对加工炮制过程中产生的核瓤可再利用,本研究为枳壳药材资源的综合利用提供了依据。3.枳实、枳壳挥发油成分比较研究3.1挥发油提取方法研究挥发油作为二者主要药效成分之一,目前对枳实、枳壳挥发油的提取方法多数为传统的水蒸气蒸馏法,而对其它方法如溶剂回流法、超声提取法等研究较少。本研究采用GC-MS技术分别对挥发油成分、石油醚超声提取物、乙醚超声提取物、正己烷超声提取物、石油醚索式回流提取物、乙醚索式回流提取物、正己烷索式回流提取物、水蒸气蒸馏法提取物、药典附录XD甲法提取物进行分析鉴定,首次比较分析了不同提取方法对挥发油成分的影响。结果,溶剂法提取的挥发油中大分子化合物居多,水蒸汽蒸馏法和药典甲法提取的挥发油以小分子化合物居多。其中以药典甲法提取的挥发油成分GC-MS总离子流图不仅峰的个数多,而且经鉴定的成分也较多,其次是水蒸汽蒸馏法。表明,不同提取方法影响挥发油的成分组成和各成分的相对含量,提示枳实、枳壳挥发油的研究应综合考虑多种提取方法。3.2不同产地枳实、枳壳挥发油成分比较研究采用药典附录XD甲法提取枳实、枳壳中的挥发油,运用GC-MS法对枳实、枳壳挥发油成分进行分析。结果,柠檬烯和芳樟醇是枳实、枳壳挥发油中的主要成分。不同产地枳实中柠檬烯相对含量在22.99%～28.19%之间,芳樟醇相对含量在13.26%～18.86%之间,a-松油醇相对含量在1.81%～2.55%之间,香芹酚相对含量在0.18%～0.89%之间,香叶醇相对含量在0.15%～0.41%之间；不同产地枳壳中柠檬烯相对含量在9.44%～47.81%之间,芳樟醇相对含量在10.24%～11.90%之间,a-松油醇相对含量在3.15%～3.72%之间,香芹酚相对含量在0.09%～0.28%之间,香叶醇的相对含量在0.46%～0.88%之间。研究首次发现芳樟醇和香芹酚的含量随着果实成熟度的增加而降低,而a-松油醇和香叶醇的含量随着果实成熟度的增加而升高。3.3枳实、枳壳麸炒前后挥发油成分比较研究比较江枳实和江枳壳麸炒前后挥发油成分差异发现,麸炒后柠檬烯的含量升高,与文献报道相符。且麸炒后,成分种类和成分间的比例也发生了变化。炮制前后挥发油GC-MS图谱显示,在相同的保留时间处有峰的升高或降低以及出现新的峰或峰消失的现象。江枳实经麸炒后,芳樟醇/柠檬烯的比值从麸炒前的0.57降至0.29；江枳壳经麸炒后,芳樟醇/柠檬烯的比值从麸炒前的1.06降至0.25。结果表明,炮制后枳实、枳壳挥发油不仅化学成分含量发生变化,而且挥发油主要成分芳樟醇和柠檬烯的比例也发生较大变化,研究结果为进一步揭示枳实、枳壳药材炮制机理提供了实验依据。4.首次对总酚酸提取工艺进行了优化目前,对枳实、枳壳中功效成分提取方法研究主要集中在黄酮类化合物、辛弗林、挥发油等方面,对抗氧化成分酚酸类提取工艺研究较少。本课题采用超声波技术,运用响应面分析法(Response Surface Method, RSM)对总酚酸提取工艺进行优化,以没食子酸为对照,采用比色法测定,确定提取总酚酸的最优工艺为：56%乙醇、液料比28：1、温度30℃、超声功率为400W,提取2次,每次20min。本研究为枳实、枳壳中酚酸类成分的开发利用奠定了基础。5.枳实、枳壳药材质量评价研究目前,化学评价法在药材质量评价中应用广泛,但评价指标的选择尚有局限。如本课题研究的枳实、枳壳药材,现行药典标准以不同的成分为指标,对同来源药材采收期的制定及质量评价存在局限。本研究首次以酸橙挂果到果实成熟的整个生长期为切入点,以多指标成分跟踪整个生长周期内化学成分动态变化规律,发现：随着酸橙果实成熟度增加,总黄酮、总生物碱、总酚酸、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量均呈现递减的变化趋势；柚皮苷、芸香柚皮苷的含量呈现先增加后降低的变化趋势；柠檬苦素的含量呈现先升高,随后下降再升高再下降的波动变化。因此,参考现行药典评价指标,对同来源枳实、枳壳药材采收期的研究及质量评价以相同的成分为指标,分别研究制定枳实、枳壳药材中所含柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量限度,更能全面体现同属同类药材的共性和个性。由于挥发油成分组成的不稳定性,且挥发油总量随着酸橙果实成熟度的增加而减少；芳樟醇和香芹酚的含量随着果实成熟度的增加而降低,a-松油醇和香叶醇的含量随着果实成熟度的增加而升高。因此,对枳实、枳壳药材挥发油的质量评价应着眼于挥发油总量及挥发油成分中芳樟醇、香芹酚、a-松油醇、香叶醇的含量。本研究对来源相近,功效相似,却又存在差异的同来源药材采收期制定及质量评价具有示范意义。由于时间及课题经费的关系,仅对重庆荣昌地区的枳实、枳壳药材进行了采收期研究,枳实、枳壳主产区及道地产区不同采收期药材化学成分动态变化规律有待进一步研究,在此基础上完善酸橙枳实、枳壳药材的采收标准及质量评价体系。