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目的:探索鸭源大肠杆菌对四环素类耐药的分子机制和四环素耐药基因(tet基因)的传播扩散机制。方法:根据CLSI2008推荐的方法,对临床分离48株鸭大肠杆菌针对四环素、土霉素、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻肟和阿米卡星共7种药物进行耐药表型检测;设计6对特异性引物分两组对48株分离菌进行tet基因的多重PCR检测,第Ⅰ组:tetB, tetC,tetD;第Ⅱ组: tetA, tetE,tetM,分析tet基因组合、分布特点;以代表性tet基因组合的分离菌做供体菌,以利福平耐药的大肠杆菌C600为受体菌,通过质粒接合试验观察tet基因和四环素类耐药性的质粒传递;分别采用定位PCR(PCR mapping)和基因克隆方法研究tetM和tetA的基因环境:设计四对特异性引物UM500、CM、DM500a和DM500b,分别PCR扩增tetM基因的上游序列、tetM基因ORF和tetM基因下游序列,试验菌株为含tetM基因的两株接合子和20株分离菌;采用基因克隆方法研究tetA的基因环境:试验菌株为两株含tetA基因的接合子,用pBluescriptⅡSK(+)作为载体质粒,将接合子质粒和载体质粒分别按以下四种方案进行酶切:○1 EcoR I和Xho I双酶切。○2 EcoR I和SalI双酶切。○3 EcoR I单酶切。○4 BamH I单酶切。然后用T4连接酶将二者酶切产物进行体外连接,克隆到感受态细胞DH5a中,用LB/AMP/DOX/X-gal/IPTG平板进行蓝白斑筛选,挑选白色菌落即为阳性重组质粒克隆株,酶切、电泳确认正确插入后,插入的目的片段用载体通用引物M13测序。用ERIC-PCR对20株分离菌进行基因分型,分析其克隆关系。结果:48株分离菌全部对土霉素和四环素耐药,耐药率100%,36株对多西环素耐药,耐药率75%;对氟苯尼考、恩诺沙星和头孢噻肟的耐药率分别为79.17%、60.4%和27.08%,对阿米卡星比较敏感,大部分鸭大肠杆菌呈现多重耐药特性。分离菌tet基因均有阳性检出,检测到的4个tet基因有3种组合类型,其中tetA+B+C 21株,tetA+B+C+M 26株,tetA+C 1株;4种tet基因均能通过质粒接合转移到受体菌,使7株接合子中的5株、5株和4株分别获得对土霉素、四环素和多西环素的耐药性,3株供体菌的4个tet基因不能同时通过质粒接合传递给受体菌。经测序分析,共得到tetM及其上游序列2632bp,上游序列为转座子Tn916,两株接合子及相应的供体菌结果相同,6株分离菌Tn916阳性,占试验菌株的30%;tetA及其上下游序列约11.9kb,上游为一些分子伴侣、dnaJ、stbE和stbD,末端为Xho I酶切位点,tetA与tetR一起位于Tn1721中,下游为tnpA、Tn21、整合子IntI和dfrA12,末端为EcoR I酶切位点,两株接合子的试验结果相同。用ERIC-PCR对20株分离菌进行基因分型,共出现六种基因型,分别描述为A、B、C、D、E和F型;细菌基因型与耐药模式和携带四环素耐药基因型之间没有明显联系。结论:鸭源大肠杆菌对四环素类的耐药有四环素外排作用、核糖体保护两种特异性机制。tet基因以三种组合(tetA+B+C)和四种组合(tetA+B+C+M)为主。4个tet基因可以同时或不同时通过质粒接合在细菌间转移,使部分受体菌获得对四环素类的耐药性。四环素耐药基因tetM和tetA可以分别由转座子Tn916和Tn1721及Tn21和整合子IntI一起在鸭大肠杆菌之间进行质粒-质粒传递。