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猪链球菌2型(Streptococcus suis Type 2,SS2)是一种重要的人猪共患病原,感染仔猪可诱发脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血症等症状,其中尤以脑膜炎最为严重,每年不仅对养猪业造成巨大的经济损失,也严重威胁着公共卫生安全。烯醇化酶(Enolase,Eno)是糖酵解过程的关键催化酶,可催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。近些年来,越来越多的研究发现原核生物Eno除了具有催化功能外,还在某些病原微生物感染的发生中发挥重要作用。本课题组前期通过SS2基因组随机展示文库与猪脑微血管内皮细胞(PBMEC)和星形胶质细胞(AC)共培养模型互作筛选到的SS2 Eno是重要的互作分子,但尚未有关于Eno在SS2突破血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)诱发脑膜炎中作用的相关报道,为此,本研究针对Eno在SS2脑膜炎发生中的作用及机制开展了以下工作:1.为阐明SS2 Eno在SS2感染机体入侵BBB中的作用,原核表达获得了重组蛋白Eno,建立共培养BBB模型,将重组Eno作用于BBB模型,模型跨内皮细胞电阻(TEER)的测定结果发现Eno可显著增加BBB模型通透性,抗体阻断Eno也可显著抑制SS2对PBMEC的粘附、入侵以及对BBB的破坏作用;ICR小鼠静脉注射Eno抗体以封闭SS2感染小鼠时Eno的作用,结果发现抗体阻断Eno可显著提升SS2感染ICR小鼠存活率;此外,抗体阻断Eno可显著抑制SS2感染小鼠脑部对EB的通透性。以上结果说明了Eno介导了SS2感染机体和对BBB的破坏。2.为探讨Eno破坏BBB的作用机制,本研究通过Annexin-V/PI双染法、Western blot(WB)等方法分析Eno刺激PBMEC的凋亡情况,结果发现:Eno可通过Caspase-8/Caspase3途径诱导PBMEC发生凋亡,抗体阻断Eno可显著抑制SS2诱导的PBMEC凋亡,说明Eno在SS2诱导的细胞凋亡中占有重要作用;为探讨凋亡在SS2入侵BBB中的作用,使用凋亡抑制剂抑制BBB模型上室PBMEC凋亡的发生,结果显示抑制凋亡可显著抑制SS2对BBB模型的穿越;除检测凋亡外,研究通过RT-PCR、WB和免疫荧光等方法检测了Eno作用于PBMEC后其细胞间紧密连接蛋白(Tight junction proteins,TJs)的表达情况,结果发现Eno可显著抑制细胞间TJs ZO-1和Occludin的表达;利用稳定表达Eno的BL21菌株(BL21-Eno)感染小鼠,并对小鼠脑部TJs的表达进行WB分析,结果发现BL21-Eno感染小鼠脑部ZO-1和Occludin表达量显著低于BL21-23a(转化p ET23a空载体的BL21)感染组。以上结果说明了Eno可通过诱导PBMEC凋亡和抑制细胞间ZO-1和Occludin的表达进而增加BBB的通透性。3.为找到Eno在PBMEC表面的受体,本研究通过Pull down、质谱分析、免疫共沉淀(Co-ip)等实验,最终发现RPSA是Eno在细胞表面的互作蛋白,免疫荧光分析结果也显示Eno与RPSA可共定位于细胞表面。4.为探讨RPSA和HSPD1在Eno诱导的PBMEC凋亡和抑制TJs表达中的作用,研究首先对Eno、RPSA、HSPD1三者的关系进行分析,WB结果显示Eno刺激细胞后RPSA和HSPD1高表达,敲低或敲除RPSA可显著抑制Eno诱导HSPD1高表达,而敲低HSPD1却对Eno诱导的RPSA表达无影响,表明Eno与RPSA结合诱导了HSPD1的高表达。进一步研究发现敲低(或敲除)RPSA和HSPD1可显著抑制Eno诱导的细胞凋亡;WB分析发现敲低或敲除RPSA可以使得Eno抑制TJs的表达得到一定程度的恢复,但是敲低HSPD1对TJs的表达抑制无影响。为进一步确定Eno与RPSA结合诱导HSPD1高表达的机制,本研究对Eno刺激后胞浆蛋白和核蛋白分别进行磷酸化蛋白组学和核蛋白组学分析,并通过WB进行验证分析,结果发现Eno与RPSA结合后胞浆p38和ERK被显著激活,进而激活下游核转录因子e IF4E,最终导致HSPD1高表达。5.为了在体内验证以上相关信号分子的表达,本研究通过携带sh RPSA和sh HSPD1的AAV9感染小鼠脑部,建立脑部敲降RPSA和或HSPD1模型,并对Eno注射或SS2感染后小鼠脑部各类样本进行相关指标的分析,结果发现基因敲降RPSA和HSPD1显著提升了SS2感染小鼠的存活率,致弱了SS2对脑部的破坏作用;免疫组化分析Eno刺激细胞活化的相关分子(RPSA、HSPD1、p38、ERK、e IF4E、Caspase-3、ZO-1、Occludin等)的表达情况,结果与体外研究结果相一致;建立SS2感染巴马香猪的脑膜炎与非脑膜炎模型,并对以上信号分子在脑膜炎感染猪脑部的表达情况做了免疫组化分析,结果与体外研究结果一致。综上,本研究发现Eno通过与细胞表面RPSA结合,激活下游p38/ERK-e IF4E信号,进而导致HSPD1表达和胞外分泌增加,最终引起细胞凋亡;Eno与RPSA结合可激活胞内Rho A信号,进而抑制ZO-1和Occludin的表达,导致BBB通透性增加。以上现象的发现及机制的阐明为SS2突破BBB机制的研究提供重要的理论基础,也为脑膜炎防治提供了借鉴。