急性肝衰竭(Acute hepatic failure，AHF)是指由肝炎病毒感染、药物中毒等各种原因导致短时间内肝脏细胞大面积坏死，进而使肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生障碍或失代偿，出现以黄疸、腹水、肝性脑病等肝功能严重障碍而导致的临床综合征。近年来干细胞生物学的兴起特别是骨髓间充质干细胞移植治疗研究的开展给急性肝衰竭患者的治疗带来了新的希望。　　骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中除了造血干细胞外的另一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有很强的可塑性，在一定刺激条件下可以跨越胚层横向分化为多种组织细胞，包括成骨细胞、脂肪样细胞、神经样细胞、心肌细胞以及肝样细胞等。虽然BMSCs在机体骨髓中含量很低，并且细胞的数量会随着机体年龄增加或体质衰弱逐渐减少，但其在体外可以大量扩增，同时可以经过特定条件诱导定向分化为肝样细胞从而参与肝脏的组织损伤修复、细胞更新、功能重建等病理生理过程，此外还具有自体供源、避免免疫排斥等优点，在肝病治疗中和肝脏组织工程领域都具有巨大应用潜能，利用其多向分化的能力治疗急性肝衰竭有着非常广阔的前景。而如何高效诱导BMSCs向肝样细胞分化成为各国学者研究的热点，这一问题的解决也是干细胞移植应用于临床肝病治疗的关键。但近年来对BMSCs向肝样细胞定向分化潜能的研究多集中在其分化特性上，对其分化机制的研究尚处于初步阶段，且在体外诱导剂方面进展甚少，干细胞移植的临床应用远未达到预期效果。因此探究BMSCs向肝样细胞分化的分子机制及寻找新的高效诱导分化的方法意义重大。　　目前研究已经证实干细胞生存的微环境直接影响与决定着其向成体干细胞的分化方向。因此越来越多的学者将微环境的研究作为各类干细胞定向分化机制研究的突破口和切入点。本课题组前期从大鼠急性肝功能衰竭的微环境这一“全景范围”入手，利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ)蛋白质组学技术成功筛选出了大鼠肝损伤组织内微环境与正常肝组织微环境的差异蛋白，并通过蛋白组学相关软件及生物信息学等方法从上述差异蛋白中筛选出BMSCs诱导分化过程中可能起作用的“关键”蛋白半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)，进一步通过诱导分化实验证明了Gal-3能够诱导大鼠BMSCs向肝样细胞分化，说明了Gal-3是一个非常有潜力的强有力的促进BMSCs向肝样细胞分化的因子。然而，该诱导过程涉及的有关信号通路分子机制尚未明确，探究这一问题有助于进一步挖掘Gal-3诱导BMSCs肝样分化的能力。　　半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中特殊的一员，广泛表达于正常组织和肿瘤组织中，主要存在于胞质中，在胞膜上及胞外基质中也有，通过特殊的氨基端结构和带有糖识别域的羧基端参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞粘附、免疫反应调节、新生血管形成和肿瘤浸润与转移等。大量研究表明Gal-3在多种细胞的再生和组织修复过程中发挥重要作用，特别是与肝细胞的再生关系密切，而确切的作用机制仍未见报道，结合我们前期实验结果推测可能与干细胞的增殖分化有关。而BMSCs分化为肝样细胞是一个极其复杂的过程，涉及多种细胞因子、胞内外蛋白、胞外基质等相互作用以及多个信号通路的交叉调控，目前普遍认为Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路、Hh信号通路、PI3K/AKT信号通路、TGF-β信号通路等参与了BMSCs肝样分化过程的调控，并发挥重要作用。其中的Wnt/β-catenin信号通路与间充质干细胞的增殖及分化密切相关，通过不同程度地调控WNT信号基因的表达，在一定条件下可以促使间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、肝样细胞等分化。　　Wnt信号途径广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，最常见的是Wnt/β-catenin信号通路。该通路主要由胞外的Wnt信号分子、胞膜上的受体、胞质中的一个动态降解复合体APC-Axin-GSK-3β复合物、关键蛋白β-catenin、下游转录因子Tcf/Lef等组成。在Wnt信号缺失时，胞质中的β-catenin主要被GSK-3β复合体磷酸化进而被泛素化降解，从而维持胞质中β-catenin低水平状态，通路处于关闭状态;当Wnt信号分子与胞膜上特异性结合后可形成Wnt-Frizzled复合体结构，抑制下游GSK-3β磷酸化活性，使胞质中β-catinin积累并核内转移激活转录因子发挥基因表达调控等作用。当前已有研究表明，Gal-3与Wnt信号通路关系密切，其在结构和功能上与通路上的重要分子Axin、GSK-3β、β-catenin等极相似，甚至有学者指出Gal-3极有可能就是Wnt/β-catenin信号通路上与β-catenin功能类似的重要调控因子。因此，我们推测在Gal-3诱导大鼠BMSCs定向分化为肝样细胞过程中，经典Wnt通路可能也占据着至关重要的角色，对Gal-3诱导大鼠BMSCs向肝样细胞定向分化过程中Wnt/β-catenin信号通路表达特征的研究可对此假设进行验证，由此为Gal-3和BMSCs在肝病的基础研究及临床应用提供实验基础。　　目的:　　探寻Gal-3诱导大鼠BMSCs向肝样细胞定向分化过程中Wnt/β-catenin信号通路表达的相关分子影响机制，为Gal-3和干细胞移植在临床上的应用提供基础性研究。　　方法:　　1.SD大鼠骨髓间充质干细胞原代分离培养及鉴定:颈椎脱臼法处死实验SD大鼠，收集股骨干和胫骨干中骨髓液，联合采用密度梯度离心法和贴壁培养法，分离出骨髓液中的骨髓间充质干细胞进行传代培养;取第4代贴壁生长的细胞制备成单细胞悬液，采用流式细胞术对细胞表面标志分子进行检测鉴定，说明已成功获得骨髓间充质干细胞。　　2.Gal-3诱导大鼠BMSCs肝样分化过程中WNT信号通路重要分子表达特征的检测:取第4代BMSCs，用预先准备好的含有0.5μg/ml Gal-3的完全培养液进行诱导培养，每2天换液一次。实验按照诱导不同阶段分5组，分别为0d组、7d组、14d组、21d组、28d组，提取各组总RNA、总蛋白质，采用Q-PCR技术检测Wnt1、Wnt3a、GSK-3β、β-catenin四个基因的mRNA水平表达情况，western blot检测β-catenin蛋白的表达情况，其中0d组作为参照组。　　3.Wnt信号通路阻滞剂和激动剂作用效果检测:取第4代BMSCs细胞，分别加入含含有Gal-3+DKK-1、Gal-3+SB216763的完全培养液，体外诱导培养28d。分别于第0d、7d、14、21d、28d在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照，然后提取总RNA、总蛋白质，采用Q-PCR检测AFP、ALB两个基因的表达，其中0d时间点作为参照组。western blot检测β-catenin、ALB两个蛋白的表达情况。　　结果:　　分离出的SD大鼠BMSCs培养24h后，大部分细胞已经贴壁，并呈集落状生长，随着培养时间延长，每个集落中细胞不断分裂增殖，形态呈漩涡状生长，外观似成纤维样细胞，呈长梭形，有伪足，排列有明显的方向性，各个集落逐渐融合。流式细胞术检测细胞表面标志分子结果显示CD29、CD44和CD90表达阳性，造血系干细胞标记分子CD34和CD45表达不明显，符合骨髓间充质干细胞特性。通过分别检测Gal-3诱导大鼠BMSCs肝样分化过程不同时段四个基因的表达，结果发现随着时间的延长，各不同时间组的Wnt1、Wnt3a、GSK-3β和β-catenin的mRNA表达存在显著差异(P＜0.01);同时，除了Wnt1的21d组与14d组(P=0.07)、GSK-3β的7d组与0d组(P=0.616)、28d组与21d组(P=0.616)外，其余各基因mRNA的表达量都与前一时间点存在显著差异(P＜0.05)，总得来看，Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达呈现逐渐上调趋势，而GSK-3β则呈现下调趋势，Western blot检测β-catenin蛋白表达呈现上调趋势，与mRNA表达水平一致。在分别加入DKK-1和SB216763后，随着诱导时间的延长，β-catenin蛋白水平在两组的表达趋势是逐渐上调的，且同一时间点的SB216763组与DKK-1组相比差异显著(P＜0.05)，前者较后者上调幅度大。ALB蛋白水平表达结果同β-catenin情况大体类似。检测两组AFP和ALB mRNA的表达，结果发现随着诱导时间的延长，除了DKK-1组在14d时ALB和AFP的表达有轻微下调外，两组在AFP和ALB mRNA水平的表达大体呈现出上调趋势，且在培养到14d后，同一时间点其中SB216762组表达AFP和ALB的量远高于DKK-1组(P＜0.05)。　　结论:　　采用密度梯度离心法和贴壁培养法的结合可成功分离纯化出SD大鼠骨髓间充质干细胞，其细胞表面CD29、CD44和CD90表达阳性，不表达CD34和CD45; Gal-3诱导SD大鼠BMSCs肝样分化与Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关，SB216763与Gal-3起协同激活通路促进分化作用，而DKK-1能一定程度拮抗通路的激活影响分化效率。