病原微生物是指可以入侵机体并引起感染甚至传染病的病原体,其中,以细菌和病毒的感染危害性最大。对于细菌感染最常用的治疗策略是使用抗生素类抗菌药物,但是,抗生素类药物的滥用严重损害机体的抵抗力,加速了耐药菌的出现和蔓延,对人类的健康构成严重威胁。因此,研发新型安全有效的抗菌剂和寻找新的抗菌策略是人类面临的一项巨大挑战。而能引发世界范围内婴幼儿、免疫力低下人群下呼吸道感染的重要病原体之一——呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV),到目前为止仍然没有安全、经济有效的疫苗或者药物可以用于RSV感染的预防和治疗。姜黄素是一种天然的多酚类药物,具有优良的抗菌、抗病毒等药理活性,但是水溶性差、生物利用度低的缺点限制了其在临床上的应用。而银纳米材料具有广谱杀死病原微生物的特性,氧化石墨烯具有制备简便、价格低廉、易修饰、表面积大等优点,在抗菌和作为药物载体等方面有广泛应用。因此,我们希望通过一定的方法将姜黄素和纳米材料比较好的结合成为一个复合体,使其兼具姜黄素的药理活性和纳米材料的独特性能,通过纳米材料提高姜黄素的药理活性,更有效地对抗病原微生物的感染。基于此,本文以姜黄素和纳米材料为着手点,制备了姜黄素功能化的无机纳米材料,并对其抗病原微生物的活性进行分析。具体的研究内容包括以下几个方面:1.姜黄素-银纳米颗粒的制备及其抗病原微生物活性分析(1)姜黄素-银纳米颗粒的制备。我们利用药物姜黄素自身具有一定的还原性,以姜黄素和硝酸银为主要原料,100 oC、一步法合成粒径均一、单分散性好、生物相容性好的姜黄素-银纳米颗粒。制备的姜黄素-银纳米颗粒的等离子共振吸收峰在410 nm处,姜黄素在反应体系中同时扮演着还原剂和包被剂的角色,通过调节姜黄素的用量可以得到粒径在10-50 nm范围内的银纳米颗粒。通过对纳米颗粒红外光谱的分析,姜黄素酮基中的氧与银发生了配位作用,使姜黄素包裹在银纳米颗粒表面;姜黄素分子中的羟基和甲氧基得到了一定程度的保留,而羟基和甲氧基对姜黄素发挥很多药理作用都起到非常重要的作用。因此,我们预测姜黄素-银纳米颗粒可能兼具姜黄素的一些药理活性和银纳米颗粒的优良特性,在分析检测、生物医学等方面有良好的应用前景。(2)姜黄素-银纳米颗粒的抗菌活性分析。我们选择了常见的革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)为研究对象,通过测定细菌存活率、细菌生长曲线、纳米材料的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度等来分析姜黄素-银纳米颗粒的抗菌活性。实验结果发现,纳米颗粒的粒径会影响姜黄素-银纳米颗粒的抗菌活性,通过分析12nm、20nm和30nm的姜黄素-银纳米颗粒的抗菌活性,发现12nm的纳米颗粒的抗菌活性最好,其对抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为0.016nm。这是由于纳米颗粒粒径越小,其比表面积越大,与细菌发生作用越充分,越容易破坏细菌的细胞壁结构,因此抗菌活性越强。通过对比姜黄素-银纳米颗粒和柠檬酸-银纳米颗粒的抗菌活性,发现纳米颗粒的包被剂也是影响抗菌活性的一个重要因素,姜黄素-银纳米颗粒抗菌是姜黄素的抗菌药理活性和银纳米颗粒的广谱杀菌特性协同作用的结果,因此抗菌活性优于柠檬酸-银纳米颗粒的抗菌活性。此外,姜黄素-银纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的耐药菌株也表现出优良的抗菌活性,最小抑菌浓度均为0.016nm。(3)姜黄素-银纳米颗粒的抗呼吸道合胞病毒活性分析。我们以呼吸道合胞病毒为研究模型,进一步探讨了姜黄素-银纳米颗粒的抗呼吸道合胞病毒活性。首先,通过光学显微镜观察细胞的病变效应,结果发现姜黄素-银纳米颗粒与病毒发生直接作用后会很大程度地降低病毒侵染细胞的能力,不会引起细胞出现明显的病变。接着,我们利用tcid50法来定量分析病毒毒力的变化,结果表明,姜黄素-银纳米颗粒与病毒发生中和作用后,会使病毒毒力下降至对照组病毒毒力的1/200,下降幅度为两个数量级;而传统的柠檬酸包被的银纳米颗粒与病毒作用后最多使病毒毒力下降至对照组病毒毒力的1/9,因此,可以发现姜黄素-银纳米颗粒具有更强的中和病毒的能力。其次,姜黄素-银纳米颗粒在预防病毒感染阶段会使病毒毒力下降至对照组病毒毒力的1/19;而在病毒感染之后的抑制作用阶段,姜黄素-银纳米颗粒会使病毒毒力下降至对照组病毒毒力的1/13。随后,我们又借助免疫荧光成像进一步验证了以上实验结果。基于我们的实验结果,姜黄素-银纳米颗粒有望发展成为一种新型的呼吸道合胞病毒的高效灭活剂。2.负载姜黄素的功能化石墨烯的制备及其抗呼吸道合胞病毒活性分析。(1)负载姜黄素的功能化石墨烯的制备。氧化石墨烯是碳纳米材料中的明星材料之一,具有易制备、易修饰、生物相容性好等优点,此外,它的比表面积大是优良的药物载体。基于此,我们对氧化石墨烯进行磺酸化和?-环糊精的功能化修饰,使其成为姜黄素的优良载体,并且功能化修饰后的石墨烯具有更好的分散性,吸收峰位置从最初的230nm红移至258nm。姜黄素一方面可以通过嵌插入?-环糊精的内部空腔而被负载,另一方面可以与石墨烯发生π-π堆积作用而被石墨烯负载,所以功能化的石墨烯具有更高的负载姜黄素的能力,对姜黄素的包封率可以达到65%,解决了姜黄素不溶于水而难以进入细胞发挥药效的难题。(2)负载姜黄素的功能化石墨烯的抗呼吸道合胞病毒活性分析。我们通过对细胞病变的观察、对病毒毒力的定量测定以及分析细胞的应答行为,详细的分析了负载姜黄素的功能化石墨烯纳米复合材料的抗呼吸道合胞病毒活性。首先,石墨烯拥有大的表面积,很容易与病毒颗粒接触而发生中和作用,使病毒丧失感染力;其次,磺酸基的成功修饰使复合纳米材料可以模拟细胞膜上的硫酸肝素糖蛋白,更易与呼吸道合胞病毒发生结合,从而阻止病毒吸附到细胞膜上;再者,功能化的复合纳米材料能高效地负载姜黄素进入细胞,使姜黄素发挥抑制病毒复制和出胞的作用。实验结果表明,在中和病毒作用阶段,功能化复合纳米材料用量为1.25?g/ml时病毒滴度下降至病毒对照组的1/24,当复合纳米材料用量为2.5?g/ml或更高时会使病毒完全丧失毒力,毒力下降幅度可以达到4个数量级;在预防病毒感染阶段,功能化复合纳米材料用量为2.5?g/ml时可以使病毒滴度下降至病毒对照组的1/32,当其用量为5.0?g/ml时可以使病毒完全丧失毒力;在病毒感染后的抑制阶段,功能化复合纳米材料用量为2.5?g/ml时可以使病毒滴度下降至病毒对照组的1/42,当其用量为5.0?g/ml时可以使病毒完全丧失毒力;而在阻碍病毒吸附阶段,功能化复合纳米材料用量为5.0?g/ml时可以使病毒毒力下降至病毒对照组的1/42。因此,负载姜黄素的功能化石墨烯复合纳米材料具有高效的抗呼吸道合胞病毒活性,在中和阶段、预防阶段和治疗阶段均具有高效抗病毒作用,并且不会对细胞产生毒性,可以实现药物和纳米材料协同抗呼吸道合胞病毒的效果,为研制新型的抗呼吸道合胞病毒制剂和寻找新的病毒防治策略提供了思路。综上所述,本文将药物姜黄素和无机纳米材料比较好的结合在一起,制备了单分散性好、生物相容性好、性能优良的姜黄素功能化银纳米颗粒,并对其抗菌活性和抗呼吸道合胞病毒活性进行了详细的分析。此外,成功构建了负载姜黄素的功能化石墨烯纳米复合材料,解决了药物姜黄素不溶于水而难发挥药效的难题,实现了纳米材料和药物协同对抗呼吸道合胞病毒感染的效果,大大减小了纳米材料和药物的使用量,进一步降低了生物毒性。本文研究的两种功能化无机纳米材料,有望发展成新型抑菌剂和抗病毒制剂,拓宽纳米材料在生物医学领域的应用。