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植物由于固着于地面的生长模式,在生命过程中不可避免会遭受到各种各样的生物胁迫与非生物胁迫。许多研究结果表明,植物当代遭受胁迫能够影响自身后续生长,并影响其有性或无性子代对该胁迫的反应,被称为植物的“胁迫记忆(Stressful Memories)”。具有胁迫记忆的植物子代当再次遭受相同胁迫时,可快速、积极地响应胁迫,提高植物对胁迫的抗耐性。这种胁迫记忆效应无论对基本科学问题如生物进化还是应用性问题如中药材环境道地性形成都具有重要研究意义。1.目的本论文以白木香离体根为研究对象,以重金属铜为逆境形式,考察多代胁迫对植物材料生长、生理指标的影响,通过代表性样品的转录组数据比较分析,获取白木香离体根受多代胁迫后在分子水平的变化,为白木香胁迫记忆现象的深入研究提供参考。2.方法2.1白木香离体根材料培养与铜胁迫浓度筛选白木香种子经表面灭菌在MS培养基上萌发获得无菌实生苗;剪取无菌苗根段经营养液震荡培养法获得离体根材料;在此基础上,以次代生根率为指标,筛选适宜的培养基铜离子浓度。2.2白木香四代铜胁迫离体根材料获取与胁迫指标检测对白木香离体根进行连续四代液体震荡培养与铜胁迫,每代分别于胁迫前后取样,通过检测系列实验材料脯氨酸与丙二醛含量,分析数据变化规律,以判断系列材料中是否产生记忆效应。2.3经历连续三代铜胁迫处理白木香离体根的转录组变化分析根据胁迫响应标志物脯氨酸指标变化情况选取代表性对照材料比较转录组数据差异,分析组间差异基因表达情况,重点挖掘脯氨酸生物合成相关基因、植物胁迫响应相关基因、植物信号转导相关基因、细胞生长相关基因、次生代谢相关基因和整体转录因子分析。3.结果3.1铜胁迫浓度筛选与次代生根情况铜胁迫可影响白木香离体根的生长及次代根生根率。随着胁迫浓度增加,白木香离体根萎蔫发黄,根尖变为黄或褐色,胁迫继代后的次代根生根情况受到显著抑制,5 mg.L-1 Cu2+浓度对白木香次代根生根率无显著影响,从10mg.L-1 Cu2+浓度开始,白木香次代根生根率降低到50%以下,25mg·L-1 Cu2+浓度下白木香次代根生根率接近0。为保障继代材料量,选择5 mg·L-1 Cu2+浓度为四代连续胁迫浓度。3.2四代铜胁迫离体根材料获取与检测获得四代胁迫前后白木香离体根样品,检测结果表明多代铜胁迫对白木香离体根胁迫前本底水平的脯氨酸含量有积累作用。在亲代受胁迫而当代未受胁迫组白木香离体根中,随着亲代遭受胁迫代数增加,四代离体根脯氨酸本底值从217μg·g-1增高到474μg·g-1。当代遭受胁迫后,脯氨酸响应值较脯氨酸本底值下降,下降幅度随代数增加而增加,从第一代下降53μg·g-1至第四代下降了 219μg·g-1。对照组四代离体根脯氨酸含量在165-217μg·g-1之间。对照组四代离体根丙二醛含量为9.41,10.22,10.45,7.00 nmol·g-1;处理组四代胁迫后丙二醛含量为25.23,22.69,21.56,12.62 nmol·g-1。因为亲代受胁迫的离体根脯氨酸本底含量表现出积累作用,我们选择亲代受三代胁迫而当代未受胁迫的白木香离体根与亲代与当代均未受胁迫的白木香离体根作为后续转录组分析材料。3.3经历连续三代铜胁迫处理白木香离体根的转录组数据分析取当代胁迫前材料和经历三代胁迫后的第4代胁迫前材料进行转录组测序和对比,共得到56467条Unigene,GC百分含量为42.4179%。将所有基因与四大数据库进行比对,共注释到29037条Unigenes,注释率为51.423%。以FDR<0.05且|log2FC |>1为差异基因筛选条件,共获得18704条差异基因,其中7794个呈上调表达,10910个呈下调表达。对差异表达基因进行KEGG富集性分析,有2186个差异基因注释到132条KEGG通路。在精氨酸与脯氨酸通路上筛选到脯氨酸生物合成的谷氨酸途径上的双功能酶P5CS上调表达,P5CR基因下调表达,脯氨酸分解途径中的脯氨酸脱氢酶PRODH基因上调表达。氧化磷酸化通路中筛选到介导铜转运的COX17上调表达,V型ATP酶全部下调表达。黄酮类生物合成途径中77.8%的DEG下调表达。过氧化物酶体生物发生通路筛选到过氧化物酶体生物发生蛋白PEX16、PEX1、PEX2、PEX7,以及PMP34、活性氧ROS代谢途径上的2个PXMP2、3个MPV17均下调表达,抗氧化系统过氧化氢代谢通路中有3个CAT差异基因上调表达,4个SOD差异基因上调表达。差异表达的转录因子有47个TFs家族共579个转录因子,其中220个上调表达,359个下调。富集差异表达TFs数量最多的 10个家族分别是ERF、NAC、bHLH、MYB、C2H2、GRAS、M YB-related、WRKY、B3以及bZIP。多数TFs家族基因以下调表达为主,WRKY家族以上调表达为主。4.结论以白木香离体根为对象,本文通过筛选铜离子胁迫处理浓度并连续四代铜胁迫处理,根据生理指标脯氨酸含量变化,创制出具有胁迫记忆效应的代表性材料。利用转录组测序技术,从数据中筛选到脯氨酸合成相关基因,分析了其他参与MAPK信号通路、黄酮类生物合成、氧化磷酸化、过氧化物酶体途径及转录因子等差异基因表达情况,为白木香多代胁迫记忆机制探索奠定了基础。