论文部分内容阅读
[背景与目的]:巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变形成的两个重要危险因素,严重危害人类健康。最近研究表明巨噬细胞源性脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)可以通过增加巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌促进泡沫细胞形成,从而发挥促As的作用。近年来,越来越多的研究证实micro RNA在As的发生和发展过程中发挥重要作用,其中,miR-182参与脂质代谢、炎症和血管生成,miR-182与T细胞的分化过程密切相关,循环miR-182可能是CAD的重要生物标志物,但是miR-182在As发生发展过程中的作用尚不明确。组蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9,HDAC9)是HDACs家族的重要成员,HDACs能催化核心组蛋白的N-末端尾部区域相应的赖氨酸残基使其发生去乙酰化作用,从而诱导基因沉默。研究发现HDAC9与脂质代谢基因表达、大中型血管病变和动脉粥样硬化等密切相关。据报道,在人不同动脉的动脉粥样硬化斑块中HDAC9表达上调。本研究的目的是探讨miR-182对巨噬细胞LPL表达及其介导的脂质蓄积和促炎细胞因子分泌的影响及其机制。我们的研究结果表明miR-182可能通过沉默HDAC9抑制LPL基因核心组蛋白H4K16去乙酰化,上调巨噬细胞LPL的表达,导致脂质蓄积和促炎细胞因子分泌显着增加。总之,这些数据表明miR-182可能作为动脉粥样硬化治疗的新型药理学靶点。[方法]:采用生物信息学分析手段,借助多种Micro RNA靶标预测网站和数据库预测并比对了不同物种间miR-182的序列、保守性及其靶标基因,在此基础上进一步分析了miR-182与潜在靶标HDAC9的结合位点及结合自由能评分等。采用双荧光素酶报告基因法分别验证了miR-182与HDAC9、miR-182与LPL之间的结合情况;通过腺病毒载体转染miR-182 mimic和miR-182 inhibitor,THP-1巨噬细胞根据分组分别转染不同浓度(0,10,20,40,80 n M)和不同时间(0、6,12,24 h)后,通过RT-PCR法检测HDAC9 m RNA水平,Western blot检测HDAC9蛋白水平;采用组蛋白去乙酰化酶活性比色分析试剂盒检测miR-182对巨噬细胞中HDAC9活性的影响;采用腺病毒载体转染HDAC9和sh HDAC9以及使用HDAC9抑制剂(曲古抑菌素A)分别处理后,Western blot检测巨噬细胞LPL基因核心组蛋白H4K16乙酰化水平,RT-PCR、Western blot等检测巨噬细胞LPL的表达水平;采用腺病毒载体分别转染miR-182 mimic、mimic-neg、miR-182 inhibitor和inhibitor-neg后,Western blot检测巨噬细胞LPL基因核心组蛋白H4K16乙酰化水平,RT-PCR、Western blot等检测巨噬细胞LPL的表达水平;采用腺病毒载体分别转染miR-182 mimic、HDAC9、miR-182 mimic+HDAC9和miR-182 mimic+sh HDAC9后,RT-PCR、Western blot等检测巨噬细胞LPL的表达水平,细胞脂蛋白脂酶活性比色法定量检测试剂盒检测LPL活性;同时,采用HPLC检测巨噬细胞内脂质变化情况;采用Western blot法检测巨噬细胞转染182 mimic后,NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平,采用ELISA检测巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1等分泌情况。[结果]:生物信息学预测分析显示miR-182在不同物种间高度保守,miR-182与HDAC9结合具有种子序列且两者的结合自由能较低,这些结果强烈表明miR-182具有结合HDAC9的潜在可能性。使用Target Scan,我们发现LPL 3’UTR没有对miR-182的结合位点。将miR-182 mimic和p-HDAC9 WT 3’UTR荧光素酶报告载体共转染到HEK 293T细胞中可以有效抑制荧光素酶活性,而HDAC9突变型组的双荧光素酶活性没有显著变化,LPL野生型组和突变型组的双荧光素酶活性均没有显著变化。此外,miR-182 mimic呈剂量和时间依赖性下调巨噬细胞中HDAC9表达,而miR-182 inhibitor处理与此相反。过表达HDAC9显着降低巨噬细胞LPL基因核心组蛋白H4K16乙酰化的水平,并下调LPL表达的水平。而腺病毒载体转染sh HDAC9或使用曲古抑菌素A处理则与此相反。腺病毒载体转染miR-182 mimic后巨噬细胞LPL基因核心组蛋白H4K16乙酰化水平显著升高,LPL的表达水平升高;而miR-182 inhibitor处理与此相反。转染miR-182mimic后能够显着增加巨噬细胞LPL基因核心组蛋白H4K16乙酰化水平并上调LPL的表达。过表达HDAC9能够拮抗miR-182 mimic对THP-1源性巨噬细胞LPL表达的作用。转染miR-182 mimic后能够显着上调巨噬细胞中的TC、FC和CE水平,而过表达HDAC9则降低巨噬细胞中的TC、FC和CE水平。THP-1源性巨噬细胞转染miR-182后再过表达HDAC9处理后,巨噬细胞中TC,FC和CE的水平与对照细胞中的水平没有显着差异。腺病毒载体转染miR-182mimic后,P65蛋白磷酸化水平的水平显着增加,p-P65核转位增加,NF-κB信号通路被激活。我们还发现,miR-182可以促进巨噬细胞LPL所介导的炎症因子(如IL-6,IL-1β、TNF-α等)的分泌。[结论]:miR-182通过沉默HDAC9抑制LPL基因核心组蛋白H4K16去乙酰化,上调巨噬细胞LPL的表达,从而促进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌。