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第一部分 DHX15调控T细胞发育和恶性转化的功能与机制研究目的:T淋巴细胞(T细胞)的发育起始于骨髓来源的淋巴样祖细胞,定位于胸腺。在胸腺T细胞发育过程中,关键信号通路的失调可导致急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)的发生。本研究鉴定出调控 T细胞发育和恶性转化的关键因子---DHX15,并通过系列实验阐明其生物学功能和分子机制。方法:对比分析正常胸腺T细胞和T-ALL原代细胞的基因表达谱,筛选在T-ALL中异常表达的潜在致癌基因。运用RNA干扰技术(shRNA)验证DHX15对T-ALL细胞生长存活的影响;构建小鼠异种移植模型和骨髓移植模型考察DHX15是否参与T-ALL的发生发展。同时,在T系特异性基因敲除小鼠(Lck-Cre;Dhx15?/?)中通过流式细胞术和单细胞转录组测序(scRNA-seq)评价DHX15缺失对T细胞发育的影响,并结合RNA测序(RNA-seq)探索DHX15调控T细胞发育和恶变的下游分子机制。进一步通过免疫印迹、荧光定量PCR、蛋白半衰期、泛素化实验等分子生物学手段研究DHX15对MYC的调控方式。最后,采用MYC过表达实验验证MYC回补能否挽救由DHX15缺失引起的T细胞表型缺陷,以明确DHX15-MYC轴的生物学意义。结果:基因表达谱分析表明相比正常胸腺和骨髓细胞,DHX15在T-ALL中特异性高表达。沉默DHX15抑制T-ALL细胞生长并诱导细胞凋亡,导致体内浸润能力被显著削弱。在T细胞发育早期敲除DHX15引起胸腺发育缺陷,主要表现为CD4-CD8-双阴性(Double negative,DN)阶段向CD4+CD8+双阳性(Double positive,DP)阶段转化过程中(DN-to-DP transition)的细胞增殖受抑。同时,DHX15缺失显著抑制NOTCH1诱导的T-ALL发生。胸腺细胞scRNA-seq和T-ALL细胞RNA-seq均提示DHX15缺失显著下调癌基因MYC的转录活性。分子机制研究发现DHX15与MYC蛋白相互作用,并通过解旋酶活性非依赖的方式拮抗E3泛素连接酶FBXW7对MYC蛋白的泛素化和降解过程,从而维持MYC的高表达。在T细胞和T-ALL细胞中过表达MYC能够显著挽救DHX15缺失引起的表型异常,证实MYC是DHX15调控T细胞生理和病理功能的重要效应分子。结论:本研究发现DHX15是调节T细胞正常发育的关键因子,并且为T-ALL发生发展所必须。DHX15-MYC轴促进T细胞在生理条件下的高速增殖,该功能可被恶性转化的肿瘤细胞劫持。DHX15对MYC的调控不依赖于经典的RNA解旋酶活性。本研究以DHX15为例,揭示了 DEAD/H-box解旋酶在T细胞生理状态和病理转归过程中的重要性和多功能性。第二部分 NOTCH1二聚体转录激活RAG1/2调控T细胞发育的机制研究目的:重组激活基因(Recombinationactivatinggene)RAG1/2特异性表达于淋巴细胞并调控V(D)J重排和细胞发育过程。目前,RAG1/2在T细胞中的谱系特异性调控机制仍不清楚。本研究旨在明确NOTCH1转录激活RAG1/2表达的分子机制。方法:在过表达NOTCH1单体或二聚体的T细胞中对比分析基因表达谱,筛选受到NOTCH1二聚体调控的靶基因;利用qPCR检测NOTCH1活性抑制后RAG1/2的基因表达水平;分析染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)数据,寻找NOTCH1在RAG1/2基因座的直接结合位点,并开展ChIP-qPCR、双荧光素酶(Duel-luciferase)报告基因实验和凝胶迁移实验(EMSA)验证NOTCH1二聚体结合并激活RAG1/2基因特定顺式作用元件的能力;分离小鼠造血干细胞,利用OP9共培养法构建T细胞体外发育模型,在生理条件下验证NOTCH1二聚体对RAG1/2基因的转录调控。结果:基因表达谱分析提示RAG1/2是NOTCH1的二聚依赖型靶基因;通过γ分泌酶抑制剂(GSI)抑制NOTCH1信号能够下调T细胞中RAG1/2的表达,使用野生型(WT)而非二聚缺陷型(R1984A)NOTCH1能够挽救RAG1/2基因的激活,证实RAG1/2受到NOTCH1二聚体的调控;ChIP-seq分析发现RAG基因座中RAG2-2.8 Kb存在NOTCH 1转录激活复合体潜在的结合区域,且包含配对序列位点(Sequence-paired sites,SPS);ChIP-qPCR、Duel-luciferase和EMSA实验证明NOTCH1二聚体直接结合RAG2 SPS位点并转录激活RAG1/2表达;T细胞体外发育模型证实与野生型NOTCH1相比,二聚缺陷型NOTCH1无法有效激活RAG1/2表达。结论:本研究鉴定出RAG1/2是NOTCH1的新型二聚依赖型靶基因;NOTCH1直接结合位于RAG2-2.8Kb位置的SPS增强子序列,并转录激活RAG1/2基因的表达。本研究为RAG1/2基因在T细胞发育过程中的调控机制提出新见解,并进一步揭示了NOTCH1二聚化的重要生理学意义。